胡月明， 馬 莉， 李 虹

(貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實驗室，貴州 貴陽 550004)

乙型肝炎是全球廣泛流行的傳染性疾病。大量研究表明，乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制不是單獨由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)直接引起的肝細(xì)胞損傷，而是HBV感染后引發(fā)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答和病毒共同作用的結(jié)果。因此，由細(xì)胞免疫介導(dǎo)的免疫損傷成為HBV感染肝細(xì)胞損傷機(jī)理研究的熱點。

輔助性T細(xì)胞亞群在免疫系統(tǒng)中扮演很重要的角色，可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，參與機(jī)體抗病毒的免疫應(yīng)答，對病毒清除起重要作用。輔助性T細(xì)胞17(T help 17 cells，Th17)是不同于 Thl和Th2的一種CD4+T細(xì)胞亞型，因其產(chǎn)生大量白細(xì)胞介素-17(IL-17)而命名。最新研究表明Th17細(xì)胞可以調(diào)節(jié)和控制免疫應(yīng)答[1]，其主要作用于感染組織，發(fā)揮募集中性粒細(xì)胞的生物學(xué)功能，促進(jìn)炎性反應(yīng)，對宿主抵抗特殊病原體發(fā)揮重要作用。與Th17細(xì)胞不同，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)是一類具有免疫抑制作用的CD4+T細(xì)胞亞群，能夠控制免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，減輕對機(jī)體組織的免疫損傷。Th17和Treg細(xì)胞分別起著促進(jìn)與抑制炎癥反應(yīng)的作用。促炎性Th17細(xì)胞與抑制性Treg細(xì)胞之間平衡狀態(tài)的打破是很多炎癥及自身免疫性疾病發(fā)病的關(guān)鍵因素之一[2]。近年來，臨床對很多炎癥性疾病，例如炎性腸病、視網(wǎng)膜炎和心肌炎患者體內(nèi)促炎性Th17細(xì)胞與抑制性Treg細(xì)胞間平衡作用的研究都已取得突破性進(jìn)展[3-5]。對 CHB患者體內(nèi) Th17細(xì)胞或Treg細(xì)胞的研究也已展開。然而，慢性HBV感染后不同臨床類型患者體內(nèi)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞平衡作用的研究鮮有報道。

為探討Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)與乙型肝炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，我們選取HBV感染后肝細(xì)胞不同程度損傷的患者，檢測其外周血Th17和Treg細(xì)胞比例的變化，探討其介導(dǎo)的免疫反應(yīng)與乙型肝炎病理損傷的可能關(guān)聯(lián)性，以期為臨床治療的監(jiān)測和預(yù)后的判斷提供依據(jù)。

材料和方法

一、研究對象

收集2011年12月至2012年7月貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科及貴陽市第五人民院肝病科門診及住院患者116例，所有患者的診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會、感染病學(xué)分會《慢性乙型肝炎防治指南2011年更新版》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，同時排除合并其他類型肝炎病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性肝炎等疾病，無既往病史。

1.無病狀乙型肝炎病毒攜帶者(asymptomatic hepatitis B virus carrier，ASC)組 ASC 患者34例，男22例，女12例，年齡28～41歲。

2.慢性乙型肝炎(chronic hepatitis Bpatient，CHB)組 CHB患者50例，男38例，女12例，年齡14～72歲。

3.肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)伴活動性肝炎組(簡稱HCC組)HCC患者32例，男21例，女11例，年齡24～51歲。所選患者近期未接受干擾素及抗病毒藥物治療，未進(jìn)行放化療。

4.正常對照組 選取貴陽市第一人民醫(yī)院健康體檢者30名，男16名，女14名，年齡15～56歲。入選標(biāo)準(zhǔn):無糖尿病、結(jié)核病、自身免疫性疾病和近期感染史;無肝炎癥狀和體征，血壓正常，心肺功能正常;乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陰性，抗丙型肝炎病毒(HCV)陰性。

二、標(biāo)本采集

以無菌方式采集所有對象晨起空腹靜脈血10 mL，平均分為2份。一份不加抗凝劑，分離血清后用于檢測ALT、AST水平;另一份采用EDTAK2抗凝，用于細(xì)胞分離培養(yǎng)后流式細(xì)胞儀檢測。所有標(biāo)本采集前都征得研究對象的知情同意和各醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

三、主要試劑及儀器

1.主要試劑 異硫氰酸熒光素(FITC)-抗人CD3抗體、藻紅蛋白花青苷7(PECy7)-抗人CD8抗體、藻紅蛋白(PE)-抗人IL-17抗體、抗人CD69抗體、Treg Cocktail、PECy7-抗人 IgG1 抗體、PE-抗人IgG2a抗體、破膜劑(perm2)、紅細(xì)胞裂解液、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購于美國BD Bioscience公司。RPMI 1640培養(yǎng)基(Lonza Bio Whittaker);離子霉素(ionomycin，IO)、(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸鹽(phorbol 12-myristate-13-acetate，PMA)、莫能霉素均購于美國Sigma公司。ALT和AST檢測試劑盒購自德國Siemens公司。

2.儀器 FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀(美國Becton-Dickson公司);西門子1650全自動生化分析儀(德國Siemens公司)。

四、方法

1.Th17細(xì)胞的檢測 取新鮮無菌EDTA-K2抗凝全血和RPMI1640培養(yǎng)液各250 μL混勻，分別加入2.5 μL PMA(終濃度 50 ng/mL)、5 μL 離子霉素(終濃度 1 μg/mL)和 0.8 μL 莫能霉素(終濃度1.7 μg/mL)，置于37 ℃、5%CO2刺激培養(yǎng)5 h。取培養(yǎng)后全血細(xì)胞100 μL分別加入熒光素標(biāo)記單克隆抗體 CD3-FITC 20 μL、CD8-PECy75 μL，室溫避光孵育30min。加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，PBS洗滌。加入固定破膜劑1000 μL，室溫破膜后PBS洗滌。再加入20 μL抗人IL-17-PE抗體，室溫避光孵育，PBS洗滌后立即上流式細(xì)胞儀機(jī)檢測。同時進(jìn)行同型陰性對照處理。以前向角(FSC)對側(cè)向角(SSC)圈出淋巴細(xì)胞群，以CD3+和CD8+細(xì)胞設(shè)門，從中圈出CD3+CD8－細(xì)胞，選擇CD3+CD8－IL-17+細(xì)胞群，使用IL-17同型對照調(diào)節(jié)電壓及補(bǔ)償，即得出Th17細(xì)胞占外周血CD4+淋巴細(xì)胞的比例。

2.Treg細(xì)胞的檢測 取新鮮無菌EDTA-K2抗凝全血100 μL，再加入 Treg cooktail試劑20 μL，室溫避光孵育，裂解紅細(xì)胞，PBS洗滌。立即上流式細(xì)胞儀機(jī)檢測。同時進(jìn)行同型陰性對照處理。以FSC對SSC圈出淋巴細(xì)胞群，從中圈出CD4+CD25+細(xì)胞群，再圈出CD4+CD25+CD127low細(xì)胞，以CD25為同型對照調(diào)節(jié)電壓及補(bǔ)償，記錄Treg細(xì)胞占外周血CD4+淋巴細(xì)胞的比例。

3.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析 以BD FACSTM7-Color Setup Beads和BDTMCytomter Setup Tracking Beads調(diào)整流式細(xì)胞儀，啟動FACSCanto軟件，使儀器處于最佳工作狀態(tài)。采用FACSDiva軟件檢測及分析。

4.血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平檢測 采用西門子1650全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST水平，嚴(yán)格按照試劑操作說明書進(jìn)行。

五、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組血清ALT及AST水平分析

HBV感染者及正常對照組血清ALT及AST水平檢測結(jié)果見表1。

表1 HBV感染者及正常對照組血清ALT、AST水平分析(，U/L)

表1 HBV感染者及正常對照組血清ALT、AST水平分析(，U/L)

ALT AST正常對照組組別 例數(shù)30 ＜40 ＜50 ASC組 34 ＜40 ＜50 CHB 組 50 184.5 ±40.9 197.3 ±49.7 HCC組32 425.1 ±87.1 499.5 ±78.4

二、HBV感染者外周血CD3+、CD3+CD4+T細(xì)胞比例變化

與正常對照組外周血CD3+、CD3+CD4+T細(xì)胞比例比較，ASC組、CHB組、HCC組3組均明顯降低(P＜0.05、P ＜0.01)。與 ASC 組患者外周血CD3+、CD3+CD4+T細(xì)胞比例比較，CHB組及HCC 組明顯降低(P ＜0.05、P ＜0.01)。見表2。

表2 HBV感染者和正常對照組外周血CD3+、CD3+CD4+T細(xì)胞檢測結(jié)果(，%)

表2 HBV感染者和正常對照組外周血CD3+、CD3+CD4+T細(xì)胞檢測結(jié)果(，%)

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05、＊＊P ＜0.01;與 ASC 組比較，#P ＜0.05、##P ＜0.01

細(xì)胞組別 例數(shù) C D 3+T細(xì)胞 C D 3+C D 4+T 30 68.23 ±8.68 33.41 ±6.45 A S C 組 34 66.63 ±8.53* 31.63 ±5.01*C H B 組 50 62.05 ±9.82*# 27.80 ±6.89＊＊#H C C 組 32 59.9 ±10.54＊＊## 23.61 ±8.52＊＊##正常對照組

三、HBV感染者外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例的變化

與正常對照組外周血Th17細(xì)胞比例比較，ASC組稍高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);CHB組、HCC組明顯升高(P＜0.01)，且高于ASC組(P＜0.05、P ＜0.01);HCC 組患者外周血 Th17細(xì)胞比例高于CHB組(P＜0.05)。外周血Treg細(xì)胞的比例變化趨勢與Th17細(xì)胞相同，見表3、圖1。

HBV感染者外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.327，P ＜0.01)。正常對照組 Th17/Treg比值最低，ASC組稍高，但二者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);CHB組和HCC組均明顯高于正常對照組(P ＜0.05、P ＜0.01);HCC 組明顯高于ASC組和CHB組(P＜0.05)，見表3。

表3 各組外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例檢測結(jié)果比較()

表3 各組外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例檢測結(jié)果比較()

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05、＊＊P ＜0.01;與 ASC 組比較，#P ＜0.05、##P ＜0.01;與 CHB 組比較，▲P ＜0.05

比值正常對照組組別 例數(shù) Treg細(xì)胞(%) Th17細(xì)胞(%) Th17/Treg 30 7.18 ±2.28 1.13 ±0.37 0.17 ±0.16 ASC 組 34 7.72 ±2.05 1.30 ±0.28 0.18 ±0.13 CHB 組 50 9.01 ±2.92*# 2.06 ±1.15＊＊# 0.23 ±0.19*HCC 組 32 10.86 ±1.77＊＊##▲ 5.89 ±3.31＊＊##▲ 0.54 ±0.37＊＊#▲

圖1 HBV感染者及正常對照組外周血Th17細(xì)胞、Trge細(xì)胞比例

討 論

細(xì)胞免疫在機(jī)體控制HBV感染是至關(guān)重要的，其效應(yīng)形式主要有2種:與靶細(xì)胞特異性結(jié)合，破壞靶細(xì)胞膜，直接殺傷靶細(xì)胞;另一種是釋放細(xì)胞因子，抵御感染、腫瘤等疾病。本研究對HBV感染患者外周血CD3+、CD3+CD4+T細(xì)胞比例進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CHB和HCC患者外周血CD3+、CD3+CD4+T細(xì)胞比例明顯低于ASC組和正常對照組，與文獻(xiàn)報道[8]結(jié)果一致。其認(rèn)為CD3+CD4+T細(xì)胞生成減少?？梢詫?dǎo)致特異性抗體產(chǎn)生不足，不能清除游離的HBV，這可能是造成病毒在體內(nèi)持續(xù)感染、患者病情加重的原因。

Th17細(xì)胞是最早參與抗感染免疫的效應(yīng)性T細(xì)胞。研究表明，機(jī)體適應(yīng)性免疫系統(tǒng)可以通過IL-17和固有免疫系統(tǒng)相聯(lián)系，并促進(jìn)炎癥反應(yīng)過程。為探究HBV感染后Th17細(xì)胞與乙型肝炎病情的關(guān)系，本研究對不同HBV感染階段的患者外周血Th17細(xì)胞比例變化，并結(jié)合患者肝臟功能指標(biāo)進(jìn)行了研究。實驗結(jié)果顯示，除ASC者外，CHB組和HCC組患者外周血Th17細(xì)胞比例均明顯升高，HCC組Th17細(xì)胞比例較CHB組升高更為明顯。這些均表明HBV感染后Th17細(xì)胞在T輔助細(xì)胞中所占的比例上升，且外周血Th17細(xì)胞比例與血清ALT和AST水平呈正相關(guān)。提示HBV感染后患者體內(nèi)Th17細(xì)胞參與肝細(xì)胞損傷，引起肝臟炎癥反應(yīng);并與HBV感染后肝細(xì)胞炎癥加重有關(guān)。

1995年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+T細(xì)胞回輸之后可以抑制裸鼠多種自身免疫性疾病的發(fā)生，該細(xì)胞被命名為Treg細(xì)胞。Treg細(xì)胞能夠下調(diào)機(jī)體免疫應(yīng)答的水平，發(fā)揮免疫抑制作用，控制免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，減輕對機(jī)體組織損傷以維持自身耐受。為探討HBV感染后Treg細(xì)胞與肝臟功能的關(guān)系，本研究也對各組實驗對象外周血Treg細(xì)胞的比例變化進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示ASC患者外周血Treg細(xì)胞比例與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而CHB和HCC患者外周血Treg細(xì)胞比例增高，與 Peng等[2]的報道一致。Stoop等[9]報道CD4+CD25+Treg細(xì)胞與HBV特異性T細(xì)胞的增殖反應(yīng)有關(guān)，去除Treg細(xì)胞后，HBV特異性T細(xì)胞增殖反應(yīng)增強(qiáng)，提示Treg細(xì)胞能抑制HBV特異性免疫反應(yīng)。鄭峻松等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞對效應(yīng)性T細(xì)胞的作用通過接觸機(jī)制直接作用，進(jìn)行特異性免疫抑制。那么HBV感染者外周血Treg細(xì)胞比例的增高對效應(yīng)性T細(xì)胞——Th17細(xì)胞是否有抑制作用呢?

為深入研究這一問題，本研究對受試者外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例的變化呈正相關(guān)(r=0.327，P ＜0.01)。究其原因可能為 HBV 感染導(dǎo)致患者體內(nèi)效應(yīng)性Th17細(xì)胞增多，為拮抗效應(yīng)性T細(xì)胞對機(jī)體的損傷，抑制性Treg細(xì)胞反饋性增多。另外，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的分化發(fā)育過程中都受到TGF-β的調(diào)節(jié)。朱杰等[11]的研究結(jié)果表明CHB患者血清及肝組織中TGF-β均升高，邰伯軍等[12]也證實 HCC患者體內(nèi) TGF-β顯著增高。因此，本研究中CHB和HCC患者外周血中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比例同時增高也可能是體內(nèi)TGF-β升高，促進(jìn)其分化的結(jié)果。

Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞具有共同的起源，相互構(gòu)成復(fù)雜的作用，形成一個網(wǎng)絡(luò)。Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞之間平衡狀態(tài)的打破可能是很多炎癥性疾病及自身免疫性疾病發(fā)生和發(fā)展的一個關(guān)鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn)在所有受試者中正常對照組Th17/Treg比值最低，在HBV感染患者中隨著肝細(xì)胞炎癥的加重Th17/Treg比值逐漸升高。進(jìn)一步表明盡管HBV感染后外周血中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比例均同時升高，但是其升高的幅度是不一致的;隨著肝細(xì)胞炎癥的加重，外周血Th17細(xì)胞比例的升高更為明顯，導(dǎo)致Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞平衡度破壞。我們認(rèn)為HBV感染患者外周血Th17細(xì)胞比例增高與肝細(xì)胞炎癥損傷加重可能互為因果，這也是患者病情進(jìn)一步發(fā)展的因素之一。

綜上所述，HBV感染后隨著疾病的發(fā)生、發(fā)展，外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例明顯增高。由于Th17細(xì)胞比例增高更為明顯，使其與Treg細(xì)胞構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)平衡被打破，機(jī)體趨向于Th17細(xì)胞所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，造成肝細(xì)胞損害，參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。因此，外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例的檢測可作為HBV感染后指導(dǎo)臨床免疫治療的指標(biāo)。

[1]Awasthi A，Kuchroo VK.Th17 cells:from precursors to players in inflammation and infection[J].Int Immunol，2009，21(5):489-498.

[2]Peng G，Li S，Wu W，et al.Circulating CD4+CD25+regulatory T cells correlate with chronic hepatitis B infection[J].Immunology，2008，123(1):57-65.

[3]葛 婷，唐志鵬，王 亮，等.Th17/Treg失衡與炎癥性腸病的關(guān)系[J].世界華人消化雜志，2010，18(7):689-694.

[4]林 松，伍偉鋒.Th17細(xì)胞及其在心肌炎中的作用[J].國際心血管病雜志，2009，36(3):154-156.

[5]Liu X，Yang P，Lin X，et al.Inhibitory effect of cyclosporin A and corticosteroids on the production of IFN-gamma and IL-17 by T cells in Vogt-Koyanagi-Harada syndrome [J].Clin Immunol，2009，131(2):333-342.

[6]中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會，中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J].中華肝臟病雜志，2011，19(1):13-24.

[7]Korn T，Bettelli E，Oukka M，et al.IL-17 and Th17 cells[J].Annu Rev Immunol，2009，27:485-517.

[8]鄭源海，周艷貞，林元峰，等.慢性乙型肝炎患者外周血T、B淋巴細(xì)胞變化與其HBV-DNA的水平相關(guān)性探討[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2010，28(6):584-585.

[9]Stoop JN，van der Molen RG，Kuipers EJ，et al.Inhibition of viral replication reduces regulatory T cells and enhances the antiviral immune response in chronic hepatitis B[J].Virology，2007，361(1):141-148.

[10]鄭峻松，吳 軍，易紹萱，等.CD4+CD25+Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)T細(xì)胞的作用機(jī)制分析[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2003，25(21):1881-1884.

[11]朱 杰，杜文波，高潤平，等.慢性乙型肝病患者肝組織和血清TGF-β1的測定及臨床意義[J].中國實驗診斷學(xué)，2010，14(7):1073-1075.

[12]邰伯軍，姚登福，邱歷偉，等.肝癌組織TGF-β1和IGF-Ⅱ表達(dá)水平與HBV復(fù)制關(guān)系[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23(18):2691-2693.