丁慶莉，唐古生，賀錚雯，沈 茜，秦陽(yáng)華

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上海 200433)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的乙型病毒性肝炎是我國(guó)發(fā)病率較高的疾病。在感染HBV的大部分成年人中，表現(xiàn)為一種急性、自限性的肝臟炎癥，病毒負(fù)荷的急劇下降，長(zhǎng)久的保護(hù)性體液和細(xì)胞免疫，但在另一部分受染的成年人和大多數(shù)經(jīng)垂直傳播而致病的患者中，持續(xù)的病毒感染會(huì)最終導(dǎo)致慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)[1]。然而 HBV 在機(jī)體持續(xù)性感染致慢性肝炎發(fā)生的病理機(jī)制尚未完全闡明。HBV是一種非細(xì)胞毒性病毒，當(dāng)其進(jìn)入機(jī)體后常引起一系列復(fù)雜的免疫反應(yīng)，而機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱又與HBV感染所致的不同臨床結(jié)果密切相關(guān)。在這一系列免疫應(yīng)答中，細(xì)胞免疫應(yīng)答是決定HBV感染機(jī)體后轉(zhuǎn)歸的最重要因素。輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)是近幾年發(fā)現(xiàn)的輔助性T細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞)新的功能亞群，主要通過(guò)分泌大量的白細(xì)胞介素17(interleukin 17，IL-17)來(lái)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。目前已證實(shí)Th17細(xì)胞是急性或慢性炎癥環(huán)境中重要的效應(yīng)細(xì)胞，在自身免疫性疾病、炎癥反應(yīng)、腫瘤等的發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮著重要的作用。至今，有關(guān)Th17細(xì)胞與HBV致肝臟慢性免疫性炎癥關(guān)系的研究在國(guó)內(nèi)外已見(jiàn)少量報(bào)道[2-3]，研究結(jié)果均提示Th17細(xì)胞可能在病毒性肝炎慢性化過(guò)程中具有重要作用?；谏鲜鲈?，本研究擬對(duì)臨床不同疾病程度CHB患者和健康人外周血Th17細(xì)胞及其效應(yīng)分子IL-17的水平進(jìn)行檢測(cè)，分析這些變化與患者HBV DNA載量、肝臟損傷標(biāo)志物等的關(guān)系，旨在進(jìn)一步證實(shí)Th17細(xì)胞在CHB慢性免疫炎癥損傷過(guò)程中的作用。

材料和方法

一、研究對(duì)象

隨機(jī)選取2007至2008年在長(zhǎng)海醫(yī)院感染科住院或門(mén)診治療的93例CHB患者，男68例，女25例，平均年齡(43±15)歲，其中輕度21例、中度37例、重度35例，診斷依據(jù)2005年修訂的“慢性乙型肝炎防治指南”標(biāo)準(zhǔn)[4]。所有患者沒(méi)有并發(fā)丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、人類免疫缺陷病毒感染和自身免疫性肝炎。28名健康者均為長(zhǎng)海醫(yī)院健康體檢者，其中男17名，女11名，平均年齡(29±8)歲，無(wú)心、肝、腎等器質(zhì)性疾病，亦無(wú)乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、人類免疫缺陷病毒感染和自身免疫性疾病。本研究經(jīng)長(zhǎng)海醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，每位受試對(duì)象都簽署了知情同意書(shū)。

二、標(biāo)本采集

采集CHB患者血液標(biāo)本時(shí)，有17例接受了核苷類抗病毒治療，11例未接受任何治療，其余均僅接受保肝降酶治療，均未接受甾體類藥物治療。以無(wú)菌方式采集各試驗(yàn)對(duì)象晨起空腹靜脈血，乙二胺四乙酸抗凝血5 mL用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞成分分離;不抗凝血5 mL，血清用于檢測(cè)肝功能、HBV DNA、IL-17 等。

三、外周血Th17細(xì)胞和輔助性 T細(xì)胞(T helper cell 1，Th1)細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測(cè)

取乙二胺四乙酸抗凝血 100 μL，用 100 μL含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco公司)混合后接種于96孔培養(yǎng)板(Costar公司)，同時(shí)加入終濃度為50 ng/mL的佛波醇酯(Sigma公司)、1 μg/mL離子霉素(Sigma 公司)和 1 μL/mL布雷菲德菌素 A(Becton Dickinson公司)。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱刺激培養(yǎng)5 h。收集體外刺激活化的外周血，用磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffered saline，PBS)洗滌2次。加入5 μL異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)-抗人CD4(eBioscience公司)，室溫避光溫育30 min。加入1 mL紅細(xì)胞裂解液(BD公司)室溫作用10 min，洗滌。加入固定穿膜劑500 μL(eBioscience公司)，室溫作用1 h，洗滌。分別加入5 μL藻紅蛋白(phycoerythin，PE)-抗人 IL-17(eBioscience公司)、5 μL 別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，APC)-抗人γ干擾素(interferon-gamma，IFN-γ，eBioscience公司)和同型對(duì)照抗體，室溫作用30 min，洗滌后立即用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD公司)檢測(cè)。以CD4+T細(xì)胞設(shè)門(mén)，至少計(jì)數(shù)20000個(gè)細(xì)胞，以CellQuest軟件分別IL-17和 IFN-γ表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例。

四、外周血CD4+T細(xì)胞的分離和刺激培養(yǎng)

采用無(wú)柱免疫磁珠細(xì)胞分選外周血CD4+細(xì)胞，試劑盒為 RosetteSep(加拿大 STEMCELL公司)，方法為抗體標(biāo)記和免疫密度離心負(fù)篩選法，具體步驟:取5 mL抗凝全血，加250 μL CD4+T細(xì)胞富集試劑后混勻，室溫作用20 min，用等量PBS進(jìn)行稀釋并混勻。在另一試管內(nèi)加入適量淋巴細(xì)胞分離液(上海華精生物高科技公司)，將處理好的標(biāo)本沿管壁緩緩疊加于分層液上，形成清晰界面。置水平離心機(jī)中，400×g離心20 min。用滴管直接吸出CD4+T細(xì)胞層，加入4倍量以上的 Hank’s液，充分混勻，300×g離心10 min。用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液調(diào)整到106/mL。取樣經(jīng)FITC-抗人CD4抗體染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)純度，代表性結(jié)果見(jiàn)圖1，純度＞95%進(jìn)行下一步試驗(yàn)。按100 μL 2×105/孔的細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板，同時(shí)加入終濃度為1 μg/mL CD3和2 μg/mL CD28功能性抗體(eBioscience公司)，37℃、5%CO2孵箱刺激培養(yǎng)5 h進(jìn)行細(xì)胞總RNA抽提，培養(yǎng)72 h收集上清液進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinked immunoserbent assay，ELISA)檢測(cè)。

圖1 外周血分選CD4+T細(xì)胞經(jīng)抗CD4-FITC抗體標(biāo)記后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

五、血清和培養(yǎng)上清液IL-17水平的檢測(cè)

采用ELISA檢測(cè)，試劑盒購(gòu)于eBioscience公司，操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

六、血清HBV DNA和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)的檢測(cè)

采用熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)患者血清HBV DNA水平，試劑盒購(gòu)自深圳匹基生物工程公司。采用速率法檢測(cè)血清ALT，試劑盒購(gòu)于科華生物工程公司，儀器為日立7600型全自動(dòng)生化分析儀。

七、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-17和維甲酸相關(guān)孤兒核受體(RAR-related orphan nuclear receptor C，RORC)mRNA 表達(dá)

取1×106個(gè)經(jīng)刺激或未刺激CD4+T細(xì)胞，用Trizol試劑(Invitrogen公司)抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄采用 TaKaRa PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行。再使用 SYBR?Prime-ScriptTMRT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)于Light-Cycler定量PCR儀(Roche公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)mRNA表達(dá)量為內(nèi)參照，根據(jù)待檢基因和內(nèi)參照基因擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)Ct值，按照公式相對(duì)值 =2-ΔΔCT計(jì)算出標(biāo)本中待檢基因相對(duì)于內(nèi)參照基因的相對(duì)含量。引物序列采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，IL-17上、下游引物序列:F-TGTCCACCATGTGGCCTAAGAG;R-GTCCGAAATGAGGCTGTCTTTGA。RORC上、下游引物序列:F-ACCTCACCGAGGCCATTCAG;R-TAGGCCCGGCACATCCTAAC。GAPDH上、下游引物序列:F-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC;R-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、CHB患者外周血Th17細(xì)胞比例

與正常對(duì)照組[(0.62±0.58)%]相比，CHB患者外周血CD4+IFN-γ－IL-17+T細(xì)胞(Th17細(xì)胞)的比例[(1.89±1.46)%]明顯升高(P ＜0.05)。隨著疾病的加重，Th17細(xì)胞的比例也隨之上升。重度組、中度組和輕度組外周血Th17細(xì)胞的比例分別為(2.75 ±2.89)%、(1.75 ±1.58)%和(1.24 ±0.98)%，重度組 Th17 細(xì)胞的比例顯著高于中度組、輕度組和正常對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)圖2、圖 3(a)。CHB 中度組 Th17細(xì)胞的比例也顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。然而，中度組Th17細(xì)胞的比例與輕度組、輕度組與正常對(duì)照組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。同時(shí)，本研究還觀察了CHB患者外周血CD4+IFN-γ+IL-17－T細(xì)胞(Th1細(xì)胞)的比例變化及與疾病嚴(yán)重度的關(guān)系。結(jié)果顯示，各組間Th1細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)圖2、圖3(b)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同疾病程度CHB患者和正常對(duì)照組外周血Th17細(xì)胞和Th1細(xì)胞的比例

圖3 不同疾病程度CHB患者與正常對(duì)照組外周血Th17細(xì)胞和Th1細(xì)胞的比例變化

二、CHB患者外周血純化CD4+T細(xì)胞IL-17和核轉(zhuǎn)錄因子RORC mRNA表達(dá)水平的變化

未經(jīng)刺激的CD4+T細(xì)胞IL-17和RORC mRNA表達(dá)水平各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，CD4+T細(xì)胞經(jīng)抗CD3和抗CD28單抗刺激后，CHB重度組IL-17和RORC mRNA表達(dá)水平明顯高于輕度組和正常對(duì)照組(P＜0.05)，且IL-17 mRNA表達(dá)在中度組與正常對(duì)照組間也存在差異，但CHB重度組與中度組之間、輕度組與正常對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖4。

三、CHB患者血清和CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)液IL-17水平的變化

各組間IL-17水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖 5(a)。隨后，測(cè)定經(jīng)純化的CD4+T細(xì)胞刺激后的培養(yǎng)液的IL-17水平。與正常對(duì)照組相比，CHB患者CD4+T細(xì)胞刺激后的培養(yǎng)液中IL-17水平顯著升高(P＜0.05);且隨疾病嚴(yán)重程度的增加，IL-17的表達(dá)水平亦隨之增加。CHB重度組CD4+T細(xì)胞刺激后的培養(yǎng)液中IL-17的水平為(4535.69 ±1857.31)pg/mL，明顯高于中度組[(2472.01 ±1139.43)pg/mL]、輕度組[(1664.38 ±468.20)pg/mL]和正常對(duì)照組[(1421.17 ±471.16)pg/mL](P ＜0.05)，見(jiàn)圖5(b)。雖然CHB中度組IL-17水平稍高于輕度組和正常對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);輕度組和正常對(duì)照組之間也無(wú)差異(P＞0.05)。

圖4 不同疾病程度CHB患者和正常對(duì)照組外周血純化CD4+T細(xì)胞經(jīng)功能性抗CD3和抗CD28單克隆抗體刺激后IL-17和RORC mRNA的表達(dá)水平

圖5 不同疾病程度CHB患者與正常對(duì)照組血清和外周血純化CD4+T細(xì)胞經(jīng)功能性抗CD3和抗CD28單克隆抗體刺激72 h后培養(yǎng)液的IL-17表達(dá)水平

四、CHB患者外周血Th17比例與肝臟損傷的關(guān)系

CHB患者外周血Th17細(xì)胞比例與血清ALT水平呈明顯正相關(guān)(P＜0.01)，見(jiàn)圖6(a)，與血清 HBV DNA載量無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)，見(jiàn)圖6(b)。

圖6 CHB患者外周血Th17細(xì)胞與血清ALT水平及HBV DNA載量的相關(guān)性分析

討 論

肝臟慢性炎癥及繼發(fā)性纖維化是CHB的特征。既往認(rèn)為CHB患者機(jī)體清除病毒能力降低，致使HBV可在體內(nèi)持續(xù)存在，導(dǎo)致HBV感染慢性化的免疫機(jī)制與Th1和Th2免疫應(yīng)答失調(diào)有關(guān)。CHB患者體內(nèi)的Th1細(xì)胞及其免疫應(yīng)答降低，IFN-γ和IL-2等細(xì)胞因子減少，造成Th1/Th2細(xì)胞比例失衡，直接影響了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)、自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞和B細(xì)胞功能的正常發(fā)揮。本研究發(fā)現(xiàn)CHB組外周血Th1細(xì)胞比例與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異，且與疾病的嚴(yán)重程度也無(wú)關(guān)系，表明HBV感染慢性化不是單一因素作用的結(jié)果，還存在其他的免疫機(jī)制。近來(lái)，大量的研究已證實(shí)Th17細(xì)胞參與了多種肝臟疾病的發(fā)生機(jī)制，在酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化等疾病中，Th17細(xì)胞發(fā)揮了誘導(dǎo)固有免疫應(yīng)答、中性粒細(xì)胞趨化激活、產(chǎn)生炎癥反應(yīng)等作用，在對(duì)肝臟的損傷及疾病的進(jìn)展中也均起到重要作用[5-6]。同時(shí)，有文獻(xiàn)報(bào)道Th17細(xì)胞不僅可以上調(diào)抗凋亡分子，促進(jìn)被病毒感染的細(xì)胞存活，而且可以抑制CTL對(duì)靶細(xì)胞的破壞，延長(zhǎng)病毒持續(xù)感染的時(shí)間[7]。

有關(guān)CHB疾病過(guò)程中Th17細(xì)胞的變化、與疾病的關(guān)系等研究國(guó)內(nèi)外已有一些報(bào)道，但試驗(yàn)結(jié)果卻不盡一致。楊波等[8]發(fā)現(xiàn)，CHB組和HBV相關(guān)慢加急性肝功能衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)組患者外周血Th17細(xì)胞頻率均顯著高于健康對(duì)照組，ACLF組又顯著高于CHB組患者。ACLF患者外周血Th17細(xì)胞頻率與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值和終末期肝病模型評(píng)分均呈正相關(guān)，而CHB患者外周血Th17細(xì)胞頻率與ALT水平呈正相關(guān)，與HBV DNA載量無(wú)關(guān)。Qi等[9]的研究也得到相似的結(jié)果，ACLF患者外周血Th17細(xì)胞頻率和RORC mRNA表達(dá)水平顯著高于CHB組，而CHB組則顯著高于健康對(duì)照組。然而，Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)CHB患者外周血增加的Th17細(xì)胞頻率與ALT水平及HBV DNA載量均呈正相關(guān)。林振忠等[11]也發(fā)現(xiàn)CHB患者Th17細(xì)胞的頻數(shù)明顯高于健康對(duì)照組，但與總膽紅素、直接膽紅素和ALT無(wú)相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示CHB患者外周血Th17細(xì)胞比例明顯高于正常對(duì)照組，且隨著疾病的加重，Th17細(xì)胞的比例也隨之上升，表現(xiàn)為重度組Th17細(xì)胞比例明顯高于中度組、輕度組和正常對(duì)照組，中度組Th17細(xì)胞比例也顯著高于正常對(duì)照組。為了進(jìn)一步明確CHB患者外周血Th17細(xì)胞比例的檢測(cè)結(jié)果，我們還對(duì)Th17細(xì)胞分化特異性核轉(zhuǎn)錄因子RORC mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，所獲的結(jié)果完全佐證上述發(fā)現(xiàn)。升高的Th17細(xì)胞比例是否與肝臟損傷存在一定的關(guān)聯(lián)?我們發(fā)現(xiàn)CHB患者外周血Th17細(xì)胞的比例與血清ALT水平呈明顯正相關(guān)，而與血清HBV DNA載量無(wú)相關(guān)性，這與楊波等[8]的報(bào)道完全一致。Ye等[12]已證實(shí)，CHB患者肝內(nèi)Th17細(xì)胞數(shù)量與肝臟炎癥活動(dòng)度呈正相關(guān)，該報(bào)道也是對(duì)本研究結(jié)果的有力支持。各文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果有差異，原因可能與CHB患者病例的入選條件不同有一定關(guān)系。在本研究和楊波等的報(bào)道中均將CHB按疾病嚴(yán)重程度進(jìn)行分組，其中重度組的病例數(shù)均﹥30例;而在林振忠等[11]的報(bào)道中均為CHB病例，如均為輕度患者，就較難觀察到外周血Th17細(xì)胞比例與ALT變化的關(guān)聯(lián)性。

IL-17是Th17細(xì)胞分泌的特征性炎性細(xì)胞因子，具有廣泛的細(xì)胞靶點(diǎn)，可誘導(dǎo)其他炎性細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，參與中性粒細(xì)胞趨化，引起炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損傷[5，13]。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，CHB、肝硬化、原發(fā)性肝癌和慢性肝功能衰竭患者血清IL-17和外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-17 mRNA水平均比正常對(duì)照顯著升高，在CHB和肝硬化患者的肝組織中IL-17的表達(dá)也明顯增多[8，10-12，14]。然而，這些結(jié)果并未獲得一致的支持，一些研究發(fā)現(xiàn)CHB患者血清IL-17水平與正常對(duì)照者比較無(wú)明顯差異[15-16]。本研究結(jié)果也顯示CHB患者血清IL-17水平與正常對(duì)照者比較無(wú)明顯差異。但分析試驗(yàn)對(duì)象純化CD4+T細(xì)胞刺激后的培養(yǎng)液時(shí)發(fā)現(xiàn)，CHB患者CD4+T細(xì)胞刺激后的培養(yǎng)液中IL-17的水平明顯高于正常對(duì)照者，且隨疾病嚴(yán)重程度的增加而增高。試驗(yàn)對(duì)象純化CD4+T細(xì)胞經(jīng)功能性抗CD3和抗CD28單克隆抗體模擬T細(xì)胞抗原受體激活CD4+T細(xì)胞時(shí)，CHB尤其是CHB重度和中度組患者CD4+T細(xì)胞趨向于分化更多的Th17細(xì)胞，致培養(yǎng)液中IL-17的水平高于正常對(duì)照組和CHB輕度組。關(guān)于CHB患者血清中IL-17檢測(cè)結(jié)果的差異，我們認(rèn)為可能與Th17細(xì)胞在血循環(huán)中所占比例甚少，及CHB患者多存在T細(xì)胞免疫功能抑制有關(guān)。

綜上所述，本研究的結(jié)果提示CHB患者體內(nèi)增高的Th17細(xì)胞可能是造成肝臟炎癥、促進(jìn)肝細(xì)胞損傷的主要原因之一，并與CHB的重癥化密切相關(guān)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞從CD4+T細(xì)胞分化而來(lái)，在分化中所需的部分細(xì)胞因子與Th17細(xì)胞比較類似，然而生物學(xué)功能卻存在一定的拮抗。若能增加未治療患者病例數(shù)，按治療與否和不同治療方案分組，并做治療前后相關(guān)指標(biāo)的比較，則可分析不同治療方案對(duì)相關(guān)指標(biāo)的影響，以期探討可用于評(píng)價(jià)治療效果的指標(biāo)。如果在本研究中能夠同時(shí)分析調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、效應(yīng)分子等的變化，將有助于更全面地了解CHB患者的機(jī)體免疫狀態(tài)。外周血Th17細(xì)胞比例升高可否作為CHB患者疾病進(jìn)展的標(biāo)記?Th17細(xì)胞是否可成為治療CHB的一個(gè)新靶點(diǎn)?哪些因素驅(qū)動(dòng)或參與了CHB患者Th17細(xì)胞的分化?這些問(wèn)題均有待于進(jìn)一步探索。

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