蔡 剛，吳蓓穎，范臻佳，沈 茜

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海 200025;2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院實驗診斷科，上海 200433)

盡管伴隨大規(guī)模疫苗接種，我國乙型病毒性肝炎的發(fā)病率已明顯下降，但就全世界范圍而言，我國仍是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的重度流行區(qū)域之一。在感染 HBV后，超過90%的成人可從急性感染自愈，并獲得終生免疫保護，但少數(shù)急性患者及兒童患者常進展為慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)，并可能最終導(dǎo)致肝硬化和原發(fā)性肝癌等嚴(yán)重肝臟疾病[1]。早期的研究發(fā)現(xiàn)，與急性自限性感染患者不同，慢性感染患者普遍存在T細胞功能缺陷，這被認(rèn)為是病毒難以清除的主要原因[2]。隨后多項研究證實，病毒抗原持續(xù)刺激所致的抗原特異性T細胞功能耗竭是造成T細胞功能缺陷的重要原因[3]。更進一步的研究發(fā)現(xiàn)，這種抗原特異性T細胞功能耗竭的現(xiàn)象不僅出現(xiàn)在多種慢性感染性疾病中，同時也出現(xiàn)在腫瘤的免疫病理過程中[4]。

鑒于抗原特異性T細胞在清除病毒及腫瘤細胞方面具有關(guān)鍵作用，其功能可能與這些慢性病毒性感染性疾病或腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)，目前對這方面的研究愈趨重視。人類白細胞相關(guān)抗原(human leukocyte antigen，HLA)限制性多肽(或稱之為抗原表位)存在于HBV蛋白質(zhì)抗原的多肽鏈中。目前在HBV特異性CD8+細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)識別的21個HBV抗原表位中，有16個是HLA-A2限制性的[5]。此外HLA-A*2402是我國人口中常見的HLA-Ⅰ型等位基因之一[6]。HBV特異性CTL可以識別主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ類分子與細胞內(nèi)合成的病毒蛋白肽復(fù)合物，通過對病毒相關(guān)抗原表位的識別、活化，經(jīng)穿孔素、顆粒酶依賴的途徑殺傷感染肝細胞，或通過Fas/FasL途徑啟動靶細胞的凋亡，以及通過細胞因子如γ干擾素(interferongamma，IFN-γ)等的非細胞殺傷途徑抑制病毒的復(fù)制。在本研究中，我們利用MHC四聚體標(biāo)記技術(shù)對CHB患者外周血中HBV抗原特異性CD8+T細胞的數(shù)量和功能進行了初步分析，并觀察其與臨床指標(biāo)的聯(lián)系。

材料和方法

一、研究對象

經(jīng)臨床確診的CHB患者35例，男26例，女9例，年齡22～79歲，中位數(shù)45歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2010版國家“慢性乙肝防治指南”[7]。所有研究對象的HLA-A等位基因均為A02或A24。所有患者在受試前6個月內(nèi)均未進行過抗病毒治療或IFN治療，均排除同時感染丙型、丁型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)等。

二、方法

1.試劑及抗體 藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記HLA-A2402與HBV核心(core)117～125抗原肽(EYLVSFGVW)或HBV聚合酶(pol)756～764抗原肽(KYTSFPWLL)四聚體(Tetra)復(fù)合物，PE標(biāo)記HLA-A0201和HBV core18～27抗原肽 (FLPSDFFPSV)或HBV包膜(env)335～343抗原肽(WLSLLVPFV或env348～357 GLSPTVWLSV)四聚體復(fù)合物均購自Proimmune公司;多甲藻葉綠素蛋白(peridinin chlorophyll protein，PerCP)-Cy5.5-抗 CD19、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)-抗白細胞介素2(interleukin 2，IL-2)、別藻紅蛋白(allophycocyanin，APC)-抗 IFN-γ 和 APC-Cy7-抗 CD8 抗體購自BioLegend和BD-pharmingen公司;高爾基體阻斷劑布雷菲德菌素A購自eBioscience公司;穿膜劑saponin購自Invitrogen公司;離子霉素和佛波醇酯購于Sigma公司。淋巴細胞分離液購自上海精華試劑廠。

2.流式細胞術(shù)分析 10 mL肝素抗凝靜脈血經(jīng)淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)后，1 ×106個PBMC先加入2 μL四聚體進行標(biāo)記，室溫作用1 h。四聚體標(biāo)記結(jié)束后，細胞使用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌。進一步標(biāo)記 PerCP-Cy5.5-抗CD19或 APC-Cy7-抗 CD8針對膜抗原的抗體，室溫溫育30 min，PBS洗滌。需進行胞內(nèi)細胞因子抗原檢測的，PBMC先以終濃度1 μg/mL離子霉素和50 ng/mL佛波醇酯進行刺激5 h，刺激同時添加終濃度為10 μg/mL布雷菲德菌素A。細胞先標(biāo)記四聚體和膜抗原，洗滌后細胞再加入固定穿膜劑500 μL后，4℃作用過夜。PBS洗滌后，加入FITC-抗 IL-2或APC-抗IFN-γ抗體，室溫孵育30 min。洗滌后，采用BD公司CantoII流式細胞儀收集細胞，Diva軟件進行數(shù)據(jù)分析。

3.其他指標(biāo)測定 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)的測定在 Beckman Coulter UniCel?DxC800系統(tǒng)上完成;HBV表面抗原(hehpatitis B surface antigens，HBsAg)等指標(biāo)的測定在雅培ARCHITECT PLUS i2000系統(tǒng)上完成;血清HBV DNA載量測定采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，試劑購于深圳凱杰公司，最低檢出限為500 IU/mL。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用Prism5.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。PBMC四聚體標(biāo)記陽性細胞患者組與陰性患者組之間比較采用秩和檢驗，抗原特異性CD8+T細胞與總CD8+T細胞的比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CHB患者外周血HBV特異性CD8+T細胞的確定

由于MHC-抗原肽四聚體與淋巴細胞有一定的非特異性結(jié)合，因此我們通過對攜帶HLA-A02或HLA-24等位基因的正常人PBMC進行標(biāo)記，以CD19－細胞設(shè)門，確定以CD8+Tetra+/CD8+≤0.01%作為HBV特異性CD8+T細胞檢出的Cutoff值，因為所有正常供者對照 CD8+Tetra+/CD8+≤0.01%。在全部35例CHB患者中，共有9例檢出針對不同抗原肽抗原特異性CD8+T細胞的病例，其 CD8+Tetra+/CD8+＞0.01%(0.33% ～2.14%，中位數(shù)為0.95%)。見圖1。

圖1 采用流式細胞儀和四聚體技術(shù)檢測CHB患者外周血HBV抗原特異性CD8+T細胞的典型圖

二、CHB患者外周血HBV特異性CD8+T細胞效應(yīng)功能分析

采用胞內(nèi)細胞因子染色、流式細胞儀分析技術(shù)分析HBV抗原特異性CD8+T細胞IL-2和IFN-γ的分泌能力。結(jié)果顯示，HBV抗原特異性CD8+T細胞IL-2和IFN-γ的分泌能力均顯著低于患者自身的外周血總CD8+T細胞(P＜0.01)，強烈提示HBV抗原特異性CD8+T細胞存在功能缺陷，見圖2。然而，對比檢出HBV抗原特異性CD8+T細胞患者與未檢出HBV抗原特異性CD8+T細胞患者的外周血總CD8+T細胞IL-2和IFN-γ的分泌能力，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖2。

三、CHB患者外周血HBV抗原特異性CD8+T細胞檢出水平與ALT及HBV DNA載量的關(guān)系

對CHB患者外周血HBV抗原特異性CD8+T細胞進行初步功能分析后再對比HBV抗原特異性CD8+T細胞陽性患者與陰性患者血清ALT和外周血病毒載量(HBV DNA)的水平。結(jié)果顯示，HBV抗原特異性CD8+T細胞陽性患者血清ALT水平明顯高于陰性患者(P＜0.05)，HBV DNA載量則顯著低于陰性患者(P＜0.01)，見圖3。這一結(jié)果提示在HBV抗原特異性細胞陽性患者中可能存在較強的抗病毒免疫反應(yīng)。

圖2 HBV抗原特異性CD8+T細胞檢出患者(9例)和未檢出患者(26例)外周血抗原特異性CD8+T細胞和總CD8+T細胞的細胞因子表達分析

圖3 HBV抗原特異性CD8+T細胞檢出患者(9例)和未檢出患者(26例)血清ALT和HBV DNA水平比較

討 論

HBV感染的臨床轉(zhuǎn)歸與機體免疫密切相關(guān)，其中細胞免疫，尤其是HBV特異性CTL在病毒清除過程中起著重要的作用。但是，研究發(fā)現(xiàn)HBV慢性感染者體內(nèi)HBV特異性CTL存在數(shù)量和質(zhì)量上的缺陷，不能有效地清除病毒。在慢性期抗病毒T細胞反應(yīng)與急性期狀態(tài)存在明顯不同。急性感染條件下，抗原特異性T細胞活化后，其最終命運有2種可能，一是成為終末分化的效應(yīng)細胞，二是成為前體記憶細胞[8]。然而，在慢性感染條件下，無論是在動物模型還是人類疾病，抗原特異性效應(yīng)T細胞功能失調(diào)都是一種普遍的現(xiàn)象。持續(xù)的病毒刺激造成功能耗竭是效應(yīng)T細胞功能失調(diào)的重要原因[3]。在多項研究中已經(jīng)證實，程序性死亡蛋白1(programmed death-1，PD-1)和B、T淋巴細胞弱化因子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)不僅是T細胞耗竭狀態(tài)的重要表面標(biāo)志，亦是導(dǎo)致效應(yīng)T細胞耗竭的重要效應(yīng)分子[9]。研究證實CHB患者外周血和肝內(nèi)CD8+T細胞表達PD-1、BTLA(CD8+PD-1+BTLA+)的比例均顯著高于正常對照組及疾病對照組，CD8+PD-1+BTLA+T細胞分泌 IL-2和 IFN-γ的水平顯著低于CD8+PD-1－BTLA－T細胞;單獨阻斷或聯(lián)合阻斷上述分子能有效地恢復(fù)CD8+T細胞的效應(yīng)功能，包括促細胞增殖、細胞因子分泌[10]。本研究發(fā)現(xiàn)CHB患者外周血HBV抗原特異性CD8+T細胞IL-2和IFN-γ的分泌能亦顯著低于患者自身的外周血總CD8+T細胞。該結(jié)果更為明確的證實了CHB感染條件下，抗病毒T細胞效應(yīng)功能存在明顯的缺陷。

盡管本研究證實CHB患者HBV抗原特異性CD8+T細胞的功能存在明顯缺陷，然而HBV抗原特異性CD8+T細胞陽性患者血清ALT的水平明顯高于陰性患者(P＜0.05)，HBV DNA載量則顯著低于陰性患者(P＜0.01)。這些結(jié)果提示，HBV抗原特異性CD8+T細胞在外周血的出現(xiàn)，表明這些患者體內(nèi)存在較為激烈的抗病毒免疫反應(yīng)，體現(xiàn)為HBV抗原特異性T細胞檢出陽性患者的HBV病毒載量較檢出陰性患者低，同時其肝功能活動性損傷亦較為嚴(yán)重。有研究顯示，急性乙型肝炎患者外周血HBV抗原特異性CD8+T細胞的檢出率明顯高于慢性乙型肝炎患者，HBV抗原特異性CD8+T細胞百分率高的患者血清HBV DNA和HBV e抗原的清除要早于HBV抗原特異性CD8+T細胞百分率低的患者，表明HBV抗原特異性CD8+T細胞在病毒的清除和疾病的自限過程中起重要作用[11]。HBV抗原特異性CD8+T細胞究竟對CHB患者疾病的轉(zhuǎn)歸有何影響，還需進行長期的隨訪觀察。

綜上所述，本研究初步分析了CHB患者外周血抗原特異性CD8+T細胞的功能特點及與相關(guān)臨床指標(biāo)的關(guān)系。對于象CHB這樣的慢性感染性疾病，對病毒特異性T細胞進行功能分析，可能不僅有助于判斷疾病的進程、預(yù)測轉(zhuǎn)歸，更有利于認(rèn)識感染條件下免疫系統(tǒng)與病毒之間的相互作用，為通過調(diào)節(jié)免疫功能，治療CHB等慢性感染性疾病，甚至腫瘤等提供新的思路。

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