蔣 淼 樊曉明

復旦大學附屬金山醫(yī)院消化科(200540)

Ghrelin是由Kojima等[1]發(fā)現(xiàn)的一種腦腸肽，是迄今惟一的生長激素釋放激素受體(GHSR)的天然配體。研究發(fā)現(xiàn)ghrelin不僅具有增加食欲、促進胃動力的作用[2]，同時還具有強大的胃黏膜保護作用[3-4]，其機制可能與一氧化氮(NO)和內臟感覺神經(jīng)有關。多數(shù)胃感覺神經(jīng)中存在對辣椒素敏感的辣椒素受體，其接受刺激后能釋放降鈣基因相關肽、速激肽、P物質等，從而促使血管內皮細胞和胃黏膜內皮細胞中NO的合成和釋放，增加胃黏膜微循環(huán)[5]。

本實驗通過乙醇誘導大鼠急性胃黏膜損傷模型，利用辣椒素拮抗劑capsazepine阻斷胃中對辣椒素敏感的辣椒素受體，同時測定eNOS、iNOS mRNA表達變化，旨在探討ghrelin對胃黏膜保護作用的可能機制。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑

健康Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠64只(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司)，體質量200～250 g。75%乙醇(上海利康消毒高科技有限公司)。Ghrelin(GenScript公司)按10 μg/mL稀釋于注射用水，定容至20 mL。Capsazepine(Sigma公司)4 mg溶于10%乙醇溶液中，定容至10 mL。Trizol試劑、逆轉錄試劑盒(Invitrogen公司)。PCR試劑盒(Ferments公司)。

二、研究方法

1. 大鼠分組和急性胃黏膜損傷模型的建立：64只大鼠隨機分為空白對照組、乙醇模型組、ghrelin組和capsazepine組，每組各16只，實驗前禁食24 h，自由飲水。大鼠腹腔注射0.9% NaCl溶液2 mL/kg 1 h后以1 mL/100 g 75%乙醇灌胃誘導急性胃黏膜損傷模型?？瞻讓φ战M腹腔注射0.9% NaCl溶液2 mL/kg；ghrelin組大鼠腹腔注射ghrelin 20 μg/kg； capsazepine組先腹腔注射ghrelin 20 μg/kg，15 min后腹腔注射capsazepine 1 mg/kg。1 h后，空白對照組予0.9% NaCl溶液1 mL/100 g灌胃，其余兩組大鼠均予75%乙醇 1 mL/100 g 灌胃。2 h后麻醉取胃行后續(xù)研究。

2. 大體觀察：肉眼觀察各組大鼠胃大體標本。

3. 胃潰瘍指數(shù)：各組大鼠胃組織以4%甲醛溶液固定，沿胃大彎剪開，顯微鏡下觀察出血性病灶，采用測微尺計算胃黏膜損傷面積，正常胃黏膜記0分，點狀損傷記1分，病損小于1 mm記2分，1～2 mm記3分，2～3 mm記4分，依次類推，如損傷寬度大于2 mm，評分加倍，全胃評分的總和為胃潰瘍指數(shù)[6]。

4. 組織學觀察：取大鼠胃竇部組織，石蠟切片，行HE染色，光學顯微鏡下觀察黏膜損傷程度和炎性細胞浸潤程度。

5. RT-PCR法檢測eNOS和iNOS mRNA表達：根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫的基因序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成目的基因序列，eNOS引物序列上游：5′-ACC CCC GGC GCT ACG AAG AA-3′，下游：5′-TGG CAG CCG GAA GGA GGG AG-3′，片段長度320 bp；iNOS引物序列上游：5′-TGG CCA GGC TGG AAG CCG TA-3′，下游：5′-CGG GCA TCT GGT AGC CAG CG-3′，片段長度333 bp；以β-actin為內參，上游：5′- CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′，下游：5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′，片段長度150 bp。采用Trizol試劑提取全部胃竇黏膜組織的總RNA，逆轉錄合成cDNA。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s，63 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。取PCR反應產物，行1%瓊脂糖凝膠電泳，采用GENE凝膠圖像處理系統(tǒng)分析，以eNOS和iNOS基因表達量與β-actin基因表達量的比值作為目的基因的表達。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、大體病理學改變

空白對照組大鼠胃黏膜完整，未見明顯糜爛潰瘍和出血。乙醇模型組胃黏膜呈暗紅色，部分甚至呈暗黑色，表面大片黏膜脫落，壞死，觸之易出血。Ghrelin組胃底和胃體上部黏膜部分斑片狀糜爛出血，黏膜基本完整。Capsazepine組胃底和胃體上部黏膜明顯糜爛出血，部分壞死，多處潰瘍；而胃體下部和胃竇黏膜基本完整，少量糜爛潰瘍(見圖1)。

二、胃潰瘍指數(shù)

空白對照組、ghrelin組大鼠胃潰瘍指數(shù)顯著低于乙醇模型組(P<0.01)；capsazepine組胃潰瘍指數(shù)顯著高于ghrelin組(P<0.01)，但仍顯著低于乙醇模型組(P=0.028)(見圖2)。

三、組織病理學觀察

空白對照組大鼠胃黏膜完整，胃小凹結構排列整齊；乙醇模型組胃黏膜結構排列紊亂，部分區(qū)域黏膜上皮層缺失，損傷多累及胃黏膜固有腺體；ghrelin組大部分胃黏膜結構排列完整，部分胃固有腺體破壞，炎性細胞少見；capsazepine組胃黏膜各層排列尚整齊，但損傷累及胃小凹和胃固有腺體，可見變性壞死細胞，部分見出血和大量中性粒細胞、單核細胞聚集(見圖3)。

A：空白對照組；B：乙醇模型組；C：ghrelin組；D：capsazepine組

圖2 各組胃潰瘍指數(shù)比較

A：空白對照組；B：乙醇模型組；C：ghrelin組；D：capsazepine組

四、eNOS、iNOS mRNA表達

乙醇模型組、ghrelin組、capsazepine組eNOS mRNA表達均較空白對照組顯著升高(P<0.01)，ghrelin組eNOS mRNA表達較乙醇模型組顯著升高(P<0.01)，capsazepine組較ghrelin組顯著降低(P<0.01)，但與乙醇模型組無明顯差異(見圖4)。

乙醇模型組、ghrelin組、capsazepine組iNOS mRNA表達均較空白對照組顯著升高(P<0.01)，ghrelin組iNOS mRNA表達較乙醇模型組顯著降低(P<0.01)，capsazepine組較ghrelin組顯著升高(P<0.01)，而與乙醇模型組無明顯差異(見圖5)。

圖4 各組大鼠eNOS mRNA表達(RT-PCR法)

圖5 各組大鼠iNOS mRNA表達(RT-PCR法)

討 論

Ghrelin由28個氨基酸殘基組成[7]，主要來源于胃黏膜X/A樣細胞[8]。國外實驗已證實ghrelin具有胃黏膜保護作用，且與參與調控NOS/COXs的表達活性有關，但其作用機制尚不清楚[3-4]。

胃黏膜對急性應激攻擊的反應是由胃感覺神經(jīng)反射完成的，因此胃感覺神經(jīng)在保護胃黏膜的過程中起有重要作用[5]。脊髓傳入神經(jīng)為胃內感覺神經(jīng)來源之一。多數(shù)胃脊髓傳入神經(jīng)纖維上存在辣椒素受體，這類神經(jīng)又稱為辣椒素-敏感感覺神經(jīng)(capsaicin-sensitive sensory neurons, CSSN)，其受刺激后能激活與受體直接偶聯(lián)的膜離子通道，引起神經(jīng)元及其纖維釋放降鈣基因相關肽、速激肽和P物質，并向軸突末梢運輸這些肽類物質，促使血管內皮細胞和胃黏膜內皮細胞中NO的合成與釋放，NO進一步與前列腺素(PG)相互作用，參與增加胃黏膜血流量、抑制炎癥反應和維護碳酸氫鈉鹽屏障等作用，從而維持胃黏膜完整性和抵抗各種局部刺激。研究表明胃黏膜產生的ghrelin作為腦腸肽，可作用于胃外周神經(jīng)節(jié)細胞的GHSR然后傳遞信號至中樞，產生各種效應。ghrelin的胃黏膜保護作用也依賴于胃感覺神經(jīng)的完整性[9]，故推測ghrelin的胃黏膜保護作用可能與CSSN存在某種聯(lián)系。

Capsazepine作為辣椒素的異構體能競爭性結合CSSN上的辣椒素受體，從而起抑制CSSN的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，ghrelin組大鼠大體和組織病理學改變較乙醇模型組明顯改善，胃潰瘍指數(shù)明顯降低；而加入capsazepine后，大鼠胃底和胃體上部黏膜明顯糜爛出血，部分壞死，多處潰瘍，呈暗紅色；病理結果示黏膜腺體破壞，細胞變性壞死，部分見出血，中性細胞聚集；且胃潰瘍指數(shù)明顯升高。說明capsazepine能減弱ghrelin對胃黏膜的保護作用。

近年研究表明NOS特異性阻斷劑L-NAME能阻斷ghrelin的胃黏膜保護作用[10]，說明ghrelin可能是通過NO介導產生胃黏膜保護作用。大量研究表明eNOS產生的NO能舒張血管平滑肌，增加胃黏膜血流，抑制白細胞移動和減輕黏膜炎癥反應。而炎癥誘導的iNOS產生的NO具有細胞毒性作用，能產生非特異性免疫反應介導細胞損傷。兩者共同參與胃黏膜的保護和炎癥反應。本研究中，乙醇模型組iNOS mRNA表達較空白對照組顯著增加，表明iNOS表達增加后，產生大量誘導型NO，明顯加重胃黏膜損傷。Ghrelin組eNOS mRNA表達較乙醇模型組明顯增加，iNOS mRNA表達明顯下降，同時組織病理學和胃潰瘍指數(shù)亦明顯改善，表明ghrelin可能通過上調eNOS mRNA表達、抑制iNOS表達而減輕細胞損傷。而加入capsazepine后，eNOS mRNA表達較ghrelin組明顯下降，iNOS mRNA表達增強，且與乙醇模型組均無明顯差異，結合ghrelin組大體、組織學改變和胃潰瘍指數(shù)均明顯優(yōu)于capsazepine組的結果，說明capsazepine組胃黏膜損傷較ghrelin組嚴重的原因可能是capsazepine阻斷了ghrelin對NOS的調節(jié)作用，尤其是阻斷了ghrelin對iNOS的抑制作用。

總之，本實驗給予大鼠capsazepine抑制辣椒素受體后，ghrelin的胃黏膜保護作用減弱，血管源性eNOS mRNA表達較ghrelin組下降，而iNOS mRNA表達增強，表明ghrelin的胃黏膜保護作用可能由CSSN上的辣椒素受體介導。但其機制是通過胃脊髓傳入神經(jīng)和迷走神經(jīng)的胃壁內短反射，還是通過脊髓傳入神經(jīng)和迷走神經(jīng)傳遞ghrelin信號至中樞下丘腦弓狀核等部位，然后通過神經(jīng)調節(jié)激活CSSN，目前尚不清楚，仍有待進一步研究證實。

1 Kojima M, Hosoda H, Date Y, et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach[J]. Nature, 1999, 402 (6762): 656-660.

2 Papotti M, Ghè C, Cassoni P, et al. Growth hormone secretagogue binding sites in peripheral human tissues[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2000, 85 (10): 3803-3807.

3 Sibilia V, Rindi G, Pagani F, et al. Ghrelin protects against ethanol-induced gastric ulcers in rats: studies on the mechanisms of action[J]. Endocrinology, 2003, 144 (1): 353-359.

4 Brzozowski T, Konturek PC, Konturek SJ, et al. Exogenous and endogenous ghrelin in gastroprotection against stress-induced gastric damage[J]. Regul Pept, 2004, 120 (1-3): 39-51.

5 Peskar BM. Neural aspects of prostaglandin involvement in gastric mucosal defense[J]. J Physiol Pharmacol, 2001, 52 (4 Pt 1): 555-568.

6 徐叔云, 卞如濂, 陳修. 藥理實驗方法學[M]. 第2版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1991: 1158-1162.

7 Hosoda H, Kojima M, Matsuo H, et al. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2000, 279 (3): 909-913.

8 Rindi G, Necchi V, Savio A, et al. Characterisation of gastric ghrelin cells in man and other mammals: studies in adult and fetal tissues[J]. Histochem Cell Biol, 2002, 117 (6): 511-519.

9 Brzozowski T, Konturek PC, Drozdowicz D, et al. Role of central and peripheral ghrelin in the mechanism of gastric mucosal defence[J]. Inflammopharmacology, 2005, 13 (1-3): 45-62.

10 Sibilia V, Pagani F, Rindi G, et al. Central ghrelin gastroprotection involves nitric oxide/prostaglandin cross-talk[J]. Br J Pharmacol, 2008, 154 (3): 688-697.