蔡 敏 李 力 王 斌 程烽濤

上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科(200090)

胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，盡管內(nèi)鏡技術(shù)、腫瘤基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域的進(jìn)展使胃癌早期診斷取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但較多患者就診時(shí)已處于中晚期，失去手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。目前，胃癌化療藥物的研發(fā)進(jìn)展有限。新藥物研發(fā)周期長(zhǎng)，耗資大且風(fēng)險(xiǎn)高。探索既有藥物的新適應(yīng)證已成為臨床藥物研發(fā)的一條捷徑和重要策略。

腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)是人體多種疾病發(fā)生的調(diào)節(jié)系統(tǒng)和靶分子作用部位。近年來(lái)RAS與腫瘤的關(guān)系備受關(guān)注?？ㄍ衅绽且环N廣泛應(yīng)用的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)，可抑制RAS。諸多研究[1-3]顯示，卡托普利對(duì)肺癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤等腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程具有抑制作用。本研究通過(guò)探討卡托普利對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲力的影響，以期為胃癌的治療提供新途徑。

材料與方法

一、細(xì)胞株、主要試劑

人胃癌細(xì)胞株AGS(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心饋贈(zèng))；卡托普利(美國(guó)Sigma公司)；CCK-8 試劑盒、Annexin V-FITC/PI試劑盒、TUNEL試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；DAPI試劑盒(美國(guó)Sigma公司)；Transwell小室(美國(guó)Corning公司)。

二、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù)：人胃癌細(xì)胞株AGS傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，更換不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基，分別加入不同濃度(0、1、2.5、5、10、15 mmol/L)卡托普利，培養(yǎng)24、48 h待測(cè)。

2. 細(xì)胞增殖檢測(cè)：取卡托普利0、1、2.5、5、10、15 mmol/L組細(xì)胞，分別以2 000/個(gè)孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，置于酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度(A)值。細(xì)胞增殖率(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

3. 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

①DAPI 染色：采用DAPI試劑盒，參考說(shuō)明書對(duì)卡托普利0、5 mmol/L組的細(xì)胞進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察。

②Annexin V-FITC/PI雙染法：將卡托普利0、5 mmol/L 組細(xì)胞用胰酶消化，加入PBS制成細(xì)胞懸液，加入Annexin V-FITC和PI染色液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

③TUNEL法：取卡托普利0、5 mmol/L組細(xì)胞，按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。于普通光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野(×400)計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)量。凋亡細(xì)胞核濃縮，呈藍(lán)色熒光。計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)作為細(xì)胞凋亡率，AI(%)=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

4. 細(xì)胞侵襲力檢測(cè)：取卡托普利0、1、2.5、5、10、15 mmol/L組細(xì)胞，將細(xì)胞按5×104/孔接種于Transwell小室的上室，培養(yǎng)24 h后用棉簽擦去濾膜上層細(xì)胞，PBS清洗3遍，將下室置于4%多聚甲醛溶液中固定20 min，PBS清洗3遍，蘇木精染色30 min，洗凈背景色，于倒置熒光顯微鏡下隨機(jī)選取4個(gè)視野(×100,×200)，計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞侵襲率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、AGS細(xì)胞增殖率

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，卡托普利1、2.5、5、10、15 mmol/L組的細(xì)胞增殖率均較卡托普利0 mmol/L 組顯著降低，呈濃度依賴性(P<0.05)。相同濃度卡托普利處理48 h組的細(xì)胞增殖率較24 h 組顯著降低(P<0.05)(見(jiàn)圖1)。

二、AGS細(xì)胞凋亡情況

DAPI染色結(jié)果顯示，卡托普利5 mmol/L組可見(jiàn)細(xì)胞呈凋亡形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為核濃縮或碎裂，核染色質(zhì)呈新月形、圓形小體或不規(guī)則形狀，染色加深，呈現(xiàn)不均一的藍(lán)白色熒光。卡托普利0 mmol/L組細(xì)胞的細(xì)胞核完整，輕度表達(dá)均勻藍(lán)色熒光(見(jiàn)圖2)。

Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示，與卡托普利0 mmol/L組相比，卡托普利5 mmol/L組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P=0.012 1)(見(jiàn)圖3)。TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示，與卡托普利0 mmol/L組相比，卡托普利5 mmol/L組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P=0.002 7)(見(jiàn)圖4)。

圖1 CCK-8法檢測(cè)卡托普利抑制AGS細(xì)胞增殖

圖2 DAPI染色結(jié)果(×400)

圖3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)卡托普利促進(jìn)AGS細(xì)胞凋亡

圖4 TUNEL法檢測(cè)卡托普利促進(jìn)AGS細(xì)胞凋亡

三、AGS細(xì)胞侵襲力

Transwell法檢測(cè)結(jié)果顯示，卡托普利1、2.5、5、10、15 mmol/L組下室中的AGS細(xì)胞數(shù)量均較卡托普利0 mmol/L組顯著減少，細(xì)胞侵襲率降低，呈濃度依賴性(P<0.05)(見(jiàn)圖5)。

圖5 Transwell法檢測(cè)卡托普利抑制AGS細(xì)胞侵襲力

討 論

RAS是機(jī)體進(jìn)化過(guò)程中高度保守的內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)，被認(rèn)為是人體中作用最廣泛的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，廣泛存在于心、腦、肝、腎、血管、脂肪、骨髓、胚胎等組織中，發(fā)揮自分泌、旁分泌作用。RAS不僅在動(dòng)脈硬化、心力衰竭、血管生成、再灌注損傷、腦卒中等心腦血管病中發(fā)揮重要的病理生理作用，還在糖尿病、代謝綜合征、肥胖癥、帕金森病、老年癡呆、多發(fā)性硬化、肝硬化等疾病的發(fā)病機(jī)制中具有重要意義[4]。Sawyers[5]和Cully等[6]的研究指出，RAS與細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程相關(guān)，RAS可促進(jìn)心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞增殖，抑制凋亡。近來(lái)，RAS與腫瘤相關(guān)性的研究引起較大關(guān)注[7]。研究[8]指出，胃癌和肝癌等多種腫瘤組織低表達(dá)或不表達(dá)RAS，此為RAS抗腫瘤的研究提供了新思路。進(jìn)一步研究[9-10]顯示，ACEI作為RAS的抑制劑，可能對(duì)部分腫瘤具有抑制作用，但其作用機(jī)制尚未完全明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，卡托普利可抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并減弱細(xì)胞的侵襲力，對(duì)胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程具有抑制效應(yīng)，且呈濃度和(或)時(shí)間依賴性。為進(jìn)一步闡明卡托普利對(duì)胃癌的治療價(jià)值以及盡早將其向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化，需闡明卡托普利抑制胃癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。已有研究[11-13]表明，血管緊張素受體(AT)和過(guò)氧化物酶體增生物激活受體(PPAR)可能是卡托普利抑制腫瘤細(xì)胞的作用靶點(diǎn)。在肺癌中，卡托普利主要通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡抑制腫瘤發(fā)展[1]，而在乳腺癌中，卡托普利主要通過(guò)調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞雌激素受體表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖[2]。卡托普利在胃癌中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

盡管卡托普利已在體外被證實(shí)具有抗腫瘤的作用，但在大樣本人群的研究中卻存在爭(zhēng)議。蘇格蘭一項(xiàng)納入5 207例患者的回顧性研究[14]顯示，長(zhǎng)期應(yīng)用ACEI可對(duì)腫瘤的發(fā)生具有抑制作用。然而，另一項(xiàng)瑞典的研究[15]則得出了否定的結(jié)論。由此可見(jiàn)，關(guān)于ACEI的抗腫瘤作用仍需進(jìn)一步深入研究。

基于RAS的藥物研究進(jìn)展顯著，現(xiàn)已有多種ACEI和血管緊張素受體阻斷劑。作為臨床常用藥，其在高血壓、腎臟疾病、糖尿病等的應(yīng)用已得到公認(rèn)，其良好的療效和安全性已被長(zhǎng)期臨床實(shí)踐證實(shí)，有助于深入研究RAS的生物學(xué)功能和開創(chuàng)新的治療領(lǐng)域如腫瘤。本研究發(fā)現(xiàn)，卡托普利具有抗胃癌作用，其可抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲，并誘導(dǎo)凋亡，此為探索新的胃癌治療策略提供了理論依據(jù)。

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