王慶娥 朱 瀅 王 云 孫曉萌 林 琳

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化科(210029)

糖尿病性胃輕癱(diabetic gastroparesis, DGP)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)患者的常見并發(fā)癥之一，臨床表現(xiàn)主要包括腹痛、腹脹、惡心、嘔吐、早飽。DGP的發(fā)病機制尚未完全明確，研究認為高血糖、高氧化應激、胃腸神經(jīng)病變、免疫調(diào)節(jié)異常、Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cells of Cajal, ICCs)丟失、平滑肌細胞(smooth muscle cells, SMC)病變等均可能與之相關(guān)[1]。胃腸運動需神經(jīng)元、ICCs、SMC以及多種胃腸激素共同參與，SMC是運動的最終執(zhí)行者，但目前大多數(shù)研究關(guān)注于ICCs與神經(jīng)病變，SMC相關(guān)研究較少見。糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等物質(zhì)通過非酶糖基化反應，自發(fā)與葡萄糖或其他還原單糖反應生成的穩(wěn)定共價化合物[2]，Nε-羧甲基賴氨酸(Nε-carboxymethyllysine, CML)是AGEs的重要組分，可反映體內(nèi)AGEs含量[3]。本研究通過觀察DM患者胃SMC超微結(jié)構(gòu)的變化，檢測胃肌層收縮蛋白和AGEs組分CML表達，分析收縮蛋白表達與AGEs的關(guān)系，旨在探討AGEs是否與DM胃平滑肌病變有關(guān)。

材料與方法

一、標本獲取和實驗分組

1. 標本獲取：選取2012年7月至2012年12月南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院因胃腫瘤行胃切除術(shù)的30例患者的全層胃組織，取材方法參照Faussone-Pellegrini等[4]的研究，取材部位為胃體前壁、距腫瘤邊緣>5 cm處，病理顯示無腫瘤浸潤。排除標準：①年齡<18歲；②既往有腹部手術(shù)史；③術(shù)前已行放、化療；④存在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、進行性系統(tǒng)性硬化癥、系統(tǒng)性淀粉樣變性等可能導致胃輕癱的疾??；⑤術(shù) 前確診其他胃動力障礙性疾??；⑥肝、膽、胰、腸道存在器質(zhì)性病變；⑦幽門梗阻、Borrmann Ⅳ型胃癌；⑧術(shù) 后病理顯示非上皮性腫瘤。所有入選者均簽署知情同意書。

2. 實驗分組：30例患者中DM和非DM各15例，分別作為DM組和對照組。DM組：術(shù)前確診合并2型DM，DM病程>5年；對照組：術(shù)前無DM且入院時血糖正常。

二、主要試劑

RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)，BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)，小鼠抗人肌球蛋白重鏈(MHC)單克隆抗體、兔抗人α-肌動蛋白(α-actin) 單克隆抗體、兔抗人鈣調(diào)節(jié)蛋白(calponin)單克隆抗體、兔抗人CML多克隆抗體(美國Abcam公司)，TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]。

三、方法

1. 胃SMC超微結(jié)構(gòu)觀察：胃組織標本取材后迅速于冰上切出約1 mm3的環(huán)肌層組織，3%戊二醛固定，鋨酸后固定，乙醇、冰丙酮系列脫水，純丙酮+包埋液包埋，烘箱固定，超薄切片機切片，3%乙酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡觀察、拍照。

2. 蛋白質(zhì)印跡法檢測胃肌層收縮蛋白MHC、α-actin、 calponin以及CML表達：取適量胃肌層組織于液氮研缽中磨成粉狀，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠恒流30 mA 電泳，恒壓80 V轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，加入稀釋的一抗(MHC 1∶1 000，α-actin 1∶200，calponin 1∶1 000，CML 1∶100，GAPDH 1∶5 000) 4 ℃過夜，TBST洗膜3次，加入HRP標記的二抗，37 ℃溫育2 h，TBST洗膜3次，加入ECL顯色液，曝光顯影。凝膠成像分析系統(tǒng)分析、處理數(shù)據(jù)，目的蛋白相對表達量以其條帶灰度值與內(nèi)參照GAPDH條帶灰度值的比值表示。

3. 熒光定量PCR檢測胃肌層收縮蛋白MHC、α-actin、calponin mRNA表達：取適量胃肌層組織于液氮研缽中磨成粉狀，按TRIzol試劑說明書提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書在10 μL反應體系中逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以之為模板行PCR擴增，操作步驟參照熒光定量PCR試劑盒說明書。MHC引物上游：5’-GGT CAC GGT TGG GAA AGA TGA-3’，下游：5’-GGG CAG GTG TTT ATA GGG GTT-3’；α-actin引物上游：5’-GTG TTG CCC CTG AAG AGC A-3’，下游：5’-GCT GGG ACA TTG AAA GTC TCA-3’；calponin引物上游：5’-CTG TCA GCC GAG GTT AAG AAC-3’，下游：5’-GAG GCC GTC CAT GAA GTT GTT-3’；GAPDH引物上游：5’-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3’，下游：5’-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3’。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，60 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。以2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達量。

四、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、一般情況

DM組男6例，女9例，平均年齡(58.40±14.11)歲，對照組男8例，女7例，平均年齡(62.33±15.27)歲， 兩組間性別構(gòu)成，平均年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。DM組DM平均病程為(6.00±3.79)年， 糖化血紅蛋白(HbA1c)為7.20%±0.60%， 顯

著高于對照組的5.00%±0.60%(P<0.05)。

二、胃SMC超微結(jié)構(gòu)

與對照組相比，DM組胃肌層SMC超微結(jié)構(gòu)明顯異常，主要表現(xiàn)為縫隙連接破壞(圖1)、胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹、出現(xiàn)脂褐素(圖2)、細胞膜小凹數(shù)量增加(圖3)和細胞膜外基層增厚(圖4)。

三、胃肌層收縮蛋白及其mRNA表達

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，DM組胃肌層收縮蛋白MHC、α-actin、calponin表達水平較對照組顯著降低(P均<0.01)(圖5)，同時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示相應mRNA表達水平亦較對照組顯著降低，分別為0.73±0.17對1.00±0.16、0.72±0.09 對1.15±0.15和0.74±0.28對 1.14±0.09(P均<0.01)(圖6)。

A：對照組胃SMC(黑框中為正常形態(tài)線粒體)(×10 000)；B：圖A黑框內(nèi)線粒體放大結(jié)果(m所示為線粒體)(×50 000)；C、D：DM組胃SMC(m所示為腫脹的線粒體，箭頭所示為脂褐素)(×10 000)

A：對照組胃SMC；B、C：DM組胃SMC

1 Da=0.992 1 u

四、胃肌層CML蛋白表達

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，DM組胃肌層CML蛋白表達水平顯著高于對照組(2.37±0.39對0.83±0.08)(P<0.01)(圖7)。

五、胃肌層收縮蛋白與CML的相關(guān)性

Pearson相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示，DM組胃肌層MHC、 calponin mRNA表達與CML蛋白表達呈負相關(guān)(r=-0.59，P=0.02；r=-0.63，P=0.01)，α-actin mRNA表達則與CML蛋白表達無明顯相關(guān)性(r=-0.49，P=0.06)(圖8)。

A：對照組胃SMC；B、C：DM組胃SMC

A：對照組胃SMC；B、C：DM組胃SMC

*P<0.01

討 論

DGP是常見的DM并發(fā)癥，既往認為DGP大多發(fā)生于1型DM患者，但近年研究[5]顯示2型與1型DM患者的DGP發(fā)病率相似。目前關(guān)于DGP發(fā)病機制的研究多通過動物模型完成，直接獲取人體胃組織的研究較少。本實驗從行胃切除術(shù)的DM和非DM患者處獲取全層胃組織進行研究，發(fā)現(xiàn)DM患者胃肌層SMC超微結(jié)構(gòu)改變明顯，表現(xiàn)為縫隙連接破壞、胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹、出現(xiàn)脂褐素、細胞膜小凹數(shù)量增多和胞膜外基層增厚。SMC間的連接是其發(fā)生電偶聯(lián)之處，可將信號從一個細胞傳遞至另一個細胞；線粒體是細胞供能場所；胞膜小凹與鈣離子進出密切相關(guān)，而鈣離子是SMC收縮的關(guān)鍵因素。這些細胞結(jié)構(gòu)破壞可引起SMC收縮功能受損， 導致胃動力障礙。此外， 細胞膜外基層增厚可使SMC彈性減弱、營養(yǎng)障礙和萎縮[4,6]，同樣影響細胞收縮功能。

收縮蛋白是參與SMC收縮的重要組分，包括MHC、α-actin、calponin等[7]。MHC頭部具有ATP酶活性并存在α-actin結(jié)合位點，可水解ATP，與α-actin相互作用，使SMC收縮[8]。Calponin可調(diào)節(jié)平滑肌收縮，抑制細胞增生，參與維持細胞骨架[9]。本研究發(fā)現(xiàn)DM患者胃肌層MHC、α-actin、calponin蛋白和mRNA表達均顯著降低，可能導致SMC收縮功能障礙，進而參與DM胃動力障礙的發(fā)生。

此外，收縮蛋白亦為SMC的表型標記物[10]。SMC包括兩種表型，即收縮表型和增殖表型，前者收縮蛋白高表達，收縮裝置完整，具有正常收縮功能；后者產(chǎn)生細胞因子和細胞外基質(zhì)組分，收縮蛋白表達減少，收縮功能減弱[11]。胃腸道成熟的SMC可在收縮表型與增殖表型間轉(zhuǎn)換[11]。本研究發(fā)現(xiàn)DM患者胃肌層收縮蛋白表達減少，推測可能有SMC發(fā)生了表型轉(zhuǎn)換，進而導致收縮功能減弱。Calponin是一種多功能蛋白，不僅參與SMC收縮和表型維持，更是一種抗細胞增殖蛋白。停止生長的細胞重新進入細胞周期G期和增殖期時，calponin表達下調(diào)[12]。因此，本研究中calponin表達減少證實DM患者可能存在SMC向增殖表型轉(zhuǎn)換。

已知AGEs參與了多種DM并發(fā)癥的發(fā)生，如心血管病、視網(wǎng)膜病變、腎病等[13]。在DM動脈粥樣硬化中，AGEs可促進血管SMC增殖，使之向增殖表型轉(zhuǎn)換[14]。但AGEs在DM胃腸病變中的作用僅有部分報道，尚未完全明確。Bhor等[15]的研究指出，DM過程中AGEs可引起小腸刷狀緣理化特性改變。Jeyabal等[16]對DM大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，AGEs可抑制腸神經(jīng)元一氧化氮合酶表達。Chen等[17]的研究顯示，AGEs及其受體在DM大鼠空腸、回腸和結(jié)腸中表達升高。本研究發(fā)現(xiàn)DM患者胃肌層AGEs重要組分CML表達顯著升高，提示AGEs水平升高，且CML表達與收縮蛋白MHC、 calponin表達呈負相關(guān)，因此推測AGEs可能參與了DM患者的胃平滑肌病變，具體作用機制有待進一步研究。

A：MHC與CML相關(guān)性分析；B：α-actin與CML相關(guān)性分析；C：calponin與CML相關(guān)性分析

綜上所述，DM患者存在胃肌層SMC超微結(jié)構(gòu)破壞，肌層收縮蛋白減少、AGEs增多且兩者呈負相關(guān)。上述變化可能影響SMC收縮功能，進而參與DM胃動力障礙的發(fā)生。AGEs通過何種途徑影響胃肌層收縮蛋白表達以及調(diào)控收縮蛋白表達的上游機制仍有待研究。本研究的不足之處主要在于：①未行SMC表型轉(zhuǎn)換的檢測，以明確DM患者在胃肌層收縮蛋白表達減少的同時是否存在SMC表型轉(zhuǎn)換；②研究缺乏臨床胃動力學參數(shù)，因此尚不能直接證明這些病變與胃動力障礙有關(guān)，亦無法說明其間的因果關(guān)系。上述問題將在后續(xù)研究中得到進一步明確。

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