董曉雅 潘光錦 劉加軍

30多年前小鼠胚胎干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)開啟了人類對于多能干細(xì)胞研究的新篇章[1］。至1998年，人胚胎干細(xì)胞（hESCs）的發(fā)現(xiàn)則為人類再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展帶來了新的希望。目前，我們已能在體外培養(yǎng)由未著床的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離的hESCs，并使其長期維持在未分化的狀態(tài)。CD34+造血前體細(xì)胞在血液病的臨床和基礎(chǔ)研究中具有潛在的優(yōu)勢。首先，血液系統(tǒng)分級明顯，所有血液前體細(xì)胞及各類型成熟血液細(xì)胞均可由造血干細(xì)胞分化發(fā)育而來，而對各類細(xì)胞我們已有一定程度的了解。其次，體外建立hESCs向造血前體細(xì)胞分化的模型有助于我們研究造血早期發(fā)育的過程，而此前由于該過程開始于胚胎發(fā)育第一周，受條件所限我們很難詳細(xì)研究。第三，高效的體外誘導(dǎo)分化體系的建立將有助于研究各類血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展，而誘導(dǎo)得到的造血前體細(xì)胞將有可能最終應(yīng)用于臨床造血干細(xì)胞的移植[2］。經(jīng)由hESCs模擬的體外誘導(dǎo)造血發(fā)育已先后在多個體系中實(shí)現(xiàn)，主要方法包括形成擬胚體的方法，與各類基質(zhì)細(xì)胞系共培養(yǎng)的方法，以及二維單層誘導(dǎo)的方法[3-5］。每種方法均各有特點(diǎn)，鑒于此，我們利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有資源，對比hESCs/OP9共培養(yǎng)方法和二維單層誘導(dǎo)方法在誘導(dǎo)效率上的差異，以期為后續(xù)的早期造血發(fā)育研究打好基礎(chǔ)。

材料與方法

一、細(xì)胞系及主要試劑

hESCs系H1、小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞系OP9、人胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)基、胚胎干細(xì)胞基質(zhì)膠、胎牛血清、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4及重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院廣州健康研究院提供。

二、方 法

1.H1的傳代培養(yǎng)方法

選用hESCs完全培養(yǎng)基mTeSR1做常規(guī)培養(yǎng)，H1細(xì)胞經(jīng)乙二胺四乙酸（EDTA）處理后，以1∶3～4的比例接種于hESCs基質(zhì)膠Matrigel（MG）包被的6孔板中，置于5% 二氧化碳、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日換液，4 d傳一代，將細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)[6］。

2.OP9的傳代培養(yǎng)方法

用含20%胎牛血清的Alpha-MEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，OP2細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，以1∶5的比例接種于0.1% 明膠包被的10 cm盤中，置于5% 二氧化碳、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d傳一代，傳代間期不換液[7］。

3.hESCs/OP9共培養(yǎng)方法

將未分化的H1在MG包被的6孔板中培養(yǎng)3～4 d，每孔細(xì)胞密度達(dá)80%，經(jīng)0.02 g/L分散酶（dispase）處理后，用1 ml槍頭輕緩刮散成碎片，加至培養(yǎng)OP9細(xì)胞的10 cm盤中，10 cm盤中H1細(xì)胞計數(shù)約為5×106，培養(yǎng)基為Alpha-MEM加上10%胎牛血清、100μM 硫代甘油。將10 cm盤放至37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d，并在第4、6、8日半量換液[7］。H1與OP9細(xì)胞共培養(yǎng)體系的模式圖見圖1。在培養(yǎng)過程中應(yīng)注意OP9細(xì)胞密度，防止細(xì)胞出現(xiàn)脂肪化。

圖1 H1與OP9細(xì)胞共培養(yǎng)體系模式圖

4.H1的二維單層誘導(dǎo)分化方法

將未分化的H1細(xì)胞按照上述普通傳代方法經(jīng)EDTA處理后，按照1∶4比例接種到MG包被的6孔板中，并于傳代第二日細(xì)胞貼壁后更換含有細(xì)胞因子的分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為IMDM培養(yǎng)基，同時添加胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑（100×）、硫代甘油（450 mM）、非必需氨基酸（0.1 mM）、左旋谷氨酰胺 （2 mM），重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4（BMP4，50μg/L），重組人血管內(nèi)皮生長因子（VEGF，50μg/L），重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF，50μg/L）。隔日半量換液[5］。H1二維單層誘導(dǎo)分化模式圖見圖2。

5.流式細(xì)胞儀檢測

取hESCs/OP9共培養(yǎng)分化后第9日和二維單層誘導(dǎo)分化后第6日的細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶處理后，置15 ml離心管，300×g離心5 min，用流式緩沖液沖洗2遍后，再次離心棄上清液，用1 ml流式緩沖液重懸，70μm濾網(wǎng)過濾，取細(xì)胞懸液100μl，加2μl抗人PE-CyTM5-CD34熒光標(biāo)記抗體，設(shè)陰性對照，加入2μl小鼠PE-CyTM5-IgG1κ同型對照抗體。4℃作用30 min，加2 ml流式緩沖液混勻，300×g離心5 min，棄上清液，用200μl流式緩沖液重懸后置4℃，待機(jī)檢測兩類方法體外誘導(dǎo)分化CD34+細(xì)胞比例。

圖2 H1二維單層誘導(dǎo)分化模式圖

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、hESCs/OP9共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化情況

鏡下觀察傳代培養(yǎng)的H1細(xì)胞貼壁生長，呈未分化狀態(tài)，單個克隆內(nèi)細(xì)胞排列緊密，視野內(nèi)無分化細(xì)胞，見圖3A。OP9細(xì)胞傳代后亦為貼壁生長，細(xì)胞纖長，見圖3B。圖3C所示為H1細(xì)胞貼壁，共培養(yǎng)第1日的細(xì)胞形態(tài)，由圖示可知，此時H1仍處于未分化狀態(tài)。隨著分化過程的進(jìn)展，在第3～4日，貼壁的H1細(xì)胞克隆內(nèi)逐漸出現(xiàn)分化形態(tài)的細(xì)胞。而至共培養(yǎng)第9日，如圖3D所示，即出現(xiàn)典型放射狀囊樣結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)CD34+細(xì)胞。將此時的細(xì)胞經(jīng)胰酶處理后，用流式細(xì)胞儀檢測CD34+細(xì)胞的百分率。

圖3 hESCs/OP9共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化細(xì)胞圖

二、H1的二維單層誘導(dǎo)分化

如圖4A為傳代后貼壁的H1，為典型未分化狀態(tài)，后更換分化培養(yǎng)基，如圖4B在誘導(dǎo)分化第2日H1即出現(xiàn)分化現(xiàn)象，分化第6日，如圖4C，細(xì)胞密度顯著增加且分化明顯，產(chǎn)生CD34+細(xì)胞。此時將細(xì)胞用胰酶處理后，同樣用流式細(xì)胞儀檢測分化細(xì)胞中CD34+細(xì)胞比例。

圖4 二維單層誘導(dǎo)分化細(xì)胞圖

三、hESCs/OP9共培養(yǎng)方法和二維單層誘導(dǎo)方法得到CD34+細(xì)胞的百分率比較

hESCs/OP9共培養(yǎng)方法第9日，CD34+細(xì)胞的比例可達(dá)（19.7±7.9）%；二維單層誘導(dǎo)方法盡管誘導(dǎo)時間較短，但CD34+細(xì)胞的比例僅為（5.8±1.8）%。hESCs/OP9共培養(yǎng)方法誘導(dǎo)效率明顯高于二維單層誘導(dǎo)方法（實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)8次，t=3.598，df=7，P=0.009）。見圖5。

討 論

圖5 hESCs/OP9共培養(yǎng)和二維單層誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)得到CD34+細(xì)胞百分率的流式細(xì)胞術(shù)圖

目前，臨床上應(yīng)用最廣泛也最成熟的細(xì)胞替代治療方法即造血干細(xì)胞的移植。移植細(xì)胞的來源主要包括骨髓、動員的外周血以及臍帶血干細(xì)胞，但此3類細(xì)胞在臨床應(yīng)用中均受到數(shù)量和質(zhì)量上的雙重限制。盡管越來越多的研究表明，成體造血干細(xì)胞可通過體外增殖來滿足數(shù)量的需求，但是經(jīng)體外培養(yǎng)的造血干細(xì)胞在體內(nèi)造血重建的能力仍受到質(zhì)疑。而hESCs則具備體外無限增殖的能力，且能體外誘導(dǎo)分化為各級血液細(xì)胞，包括造血干/祖細(xì)胞，前體細(xì)胞以及各類成熟細(xì)胞。且通過不斷完善的體外誘導(dǎo)體系，hESCs將有可能滿足臨床造血干細(xì)胞移植的標(biāo)準(zhǔn)，并促使我們加深對人類早期造血發(fā)育機(jī)制以及各類血液疾病發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識。

我們的實(shí)驗(yàn)涉及了兩類具有代表性的誘導(dǎo)體系，其一為將hESCs與骨髓基質(zhì)細(xì)胞系共培養(yǎng)進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化。作為共培養(yǎng)體系，除在本實(shí)驗(yàn)中涉及的骨髓基質(zhì)細(xì)胞系OP9外，研究人員曾嘗試過多種不同類型，不同來源的基質(zhì)細(xì)胞，如小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞系S17、小鼠卵黃囊細(xì)胞系C166、人胎肝細(xì)胞系FH-B-hTERT等[8-10］。但目前應(yīng)用最為廣泛的仍是OP9細(xì)胞系，在過去的大量實(shí)驗(yàn)研究中，OP9共培養(yǎng)體系曾被用于體外誘導(dǎo)獲得血液系統(tǒng)各系前體細(xì)胞以及成熟的血液細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞以及巨核細(xì)胞[11］。此外，OP9共培養(yǎng)體系還有一個非常重要的優(yōu)勢，即它可以在不添加大量細(xì)胞因子的情況下相對高效地誘導(dǎo)hESCs向造血分化，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本。另有研究人員曾嘗試將擬胚體體外誘導(dǎo)與OP9共培養(yǎng)體系結(jié)合，進(jìn)行造血分化，同樣取得了比較好的結(jié)果[12］。在本實(shí)驗(yàn)中，相對于二維單層誘導(dǎo)的低誘導(dǎo)效率，OP9共培養(yǎng)體系顯得更加穩(wěn)定、高效，因此更適合于后續(xù)基礎(chǔ)研究的進(jìn)展。

本實(shí)驗(yàn)涉及的第二類誘導(dǎo)體系為二給單層誘導(dǎo)體系，該體系的優(yōu)勢在于能夠采用無飼養(yǎng)層無血清且成分完全明確的培養(yǎng)基，在體外直接將人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)為造血前體細(xì)胞，這就避免了應(yīng)用鼠源細(xì)胞及異源性血清，進(jìn)而更容易克服異種問題，有助于未來體外誘導(dǎo)得到的各類血液細(xì)胞應(yīng)用于臨床。但該系統(tǒng)較低的誘導(dǎo)效率以及更高的實(shí)驗(yàn)成本大大限制了其應(yīng)用及發(fā)展。

OP9共培養(yǎng)體系模擬了骨髓造血微環(huán)境，從而為hESCs提供了造血分化的條件，而骨髓微環(huán)境是極為復(fù)雜的，到目前為止，我們還不能完全了解所有參與造血的細(xì)胞因子、化學(xué)小分子及各類信號通路，單純通過提供幾類細(xì)胞因子而達(dá)到體外直接高效誘導(dǎo)造血分化是非常困難的。因此，對于后續(xù)基礎(chǔ)研究，我們建議以O(shè)P9共培養(yǎng)體系為主，深入了解hESCs造血分化的詳細(xì)過程及各類調(diào)控機(jī)制，從而不斷完善包括這兩類誘導(dǎo)體系在內(nèi)的各類體內(nèi)、體外造血分化方法，以期在提高誘導(dǎo)效率的同時，也不斷提高誘導(dǎo)質(zhì)量，來滿足基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的需要。

[1]Evans MJ，Kaufman MH.Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature，1981，198：154-156.

[2]Lengerke C，Daley GQ.Autologous blood cell therapies from pluripotent stem cells.Blood Rev，2010，24：27-37.

[3]Grigoriadis AE，Kennedy M，Bozec A，et al.Directed differentiation of hematopoietic precursors and functional osteoclasts from human ESand iPScells.Blood，2010，115：2769-2776.

[4]Choi KD，Yu J，Smuga-Otto K，et al.Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells.Stem Cells，2009，27：559-567.

[5]Salvagiotto G，Burton S，Daigh CA，et al.A defined，feeder-free，serum-free system to generate in vitro hematopoietic progenitors and differentiated blood cells from hESCs and hiPSCs.PLoSOne，2011，6：e17829.

[6]Ludwig TE，Bergendahl V，Levenstein ME，et al.Feeder-independent culture of human embryonic stem cells.Nat Methods，2006，3：637-646.

[7]Choi KD，Vodyanik M，Slukvin II.The hematopoietic differentiation and production of mature myeloid cells from human pluripotent stem cells.Nat Protoc，2011，6：296-313.

[8]Lim WF，Inoue-Yokoo T，Tan KS，et al.Hematopoietic cell differentiation from embryonic and induced pluripotent stem cells.Stem Cell Res Ther，2013，4：71.

[9]Moon SH，Kim JM，Hong KS，et al.Differentiation of hESCs into mesodermal subtypes：vascular-，hematopoietic and mesenchymal-lineage cells.Int J Stem Cells，2011，4：24-34.

[10]Bouhassira EE.Concise review：production of cultured red blood cells from stem cells.Stem Cells Transl Med，2012，1：927-933.

[11]Matsubara Y，Ono Y，Suzuki H，et al.OP9 bone marrow stroma cells differentiate into megakaryocytes and platelets.PLoSOne，2013，8：e58123.

[12]Woods NB，Parker AS，Moraghebi R，et al.Brief report：efficient generation of hematopoietic precursors and progenitors from human pluripotent stem cell lines.Stem Cells，2011，29：1158-1164.