1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001

壯藥假蒟藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

桂貞才1顏萍花2唐玉榮2甘日呈2

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001

目的對(duì)假蒟藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究。方法通過(guò)四大經(jīng)典鑒別法對(duì)假蒟進(jìn)行鑒別；按2010年版《中國(guó)藥典》附錄方法對(duì)假蒟的水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物進(jìn)行測(cè)定；采用HPLC對(duì)假蒟中α-細(xì)辛腦進(jìn)行含量測(cè)定和指紋圖譜研究。結(jié)果確定假蒟藥材鑒別方法、檢查限量，建立含量測(cè)定和指紋圖譜方法。結(jié)論建立的方法可為假蒟藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

假蒟；鑒別；含量測(cè)定；指紋圖譜；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

假蒟又稱(chēng)假蔞、哈蒟、假荖等，過(guò)去一直當(dāng)作常見(jiàn)的祛風(fēng)濕類(lèi)中草藥使用[1]，是中華跌打丸的重要原料之一，并收載于《中國(guó)藥典》2010版附錄中[2]。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)，假蒟資源豐富、藥食兩用，是極具民族特色的植物藥[3]，已有生藥學(xué)及化學(xué)成分等的研究報(bào)道[4-5]。為進(jìn)一步完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好地開(kāi)發(fā)利用資源，本文系統(tǒng)地進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果如下。

1 材料與儀器

1.1 藥材與試劑 假蒟采自廣西各地(見(jiàn)表1)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)蔡毅教授鑒別為Piper sarmentosum Roxb.的干燥地上部分。α-細(xì)辛腦對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：10298- 0001)；乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑為分析純。

表1 假蒟的藥材來(lái)源

1.2 儀器 1100高效液相色譜儀系統(tǒng)(美國(guó)Agilent)；半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(Leica RM2145，山海天呈科技有限公司)；光學(xué)生物顯微鏡(DM2500，德國(guó)徠卡儀器公司)；電子分析天平(BP211D，德國(guó)賽多利斯)；臺(tái)式電熱恒溫干燥箱(GZX-DH-26X30-TBS，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng))；箱式電阻爐(SXZ-4-10，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-S4，金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng))。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別 通過(guò)對(duì)多地采集的標(biāo)本，用性狀鑒別法進(jìn)行研究，匯總其性狀鑒別特征如下：本品莖呈圓柱形，表面有細(xì)縱棱，節(jié)上有不定根。葉多皺縮，展開(kāi)后呈闊卵形或近圓形，長(zhǎng)6～14cm，寬5～13cm，基部淺心形；上面棕綠色，下面灰綠色，有細(xì)腺點(diǎn)；7條葉脈于葉背突出，脈上有極細(xì)小的粉狀短柔毛；葉柄長(zhǎng)2～5cm，葉鞘長(zhǎng)為葉柄的一半；有時(shí)可見(jiàn)與葉對(duì)生的穗狀花序。氣香，味辛辣。

2.2 顯微鑒別 通過(guò)對(duì)多地采集的標(biāo)本，用顯微鑒別法進(jìn)行研究，匯總其顯微鑒別特征如下。

2.2.1 莖橫切面 表皮細(xì)胞1列，外被角質(zhì)層；非腺毛由1～2個(gè)細(xì)胞組成。皮層外側(cè)有數(shù)列厚角組織，斷續(xù)呈環(huán)。中柱維管束20～25個(gè)，環(huán)列；韌皮部外側(cè)有半圓形纖維束；木質(zhì)部較寬，導(dǎo)管徑向排列；髓鞘纖維束明顯。髓部寬廣，髓中維管束5～7個(gè)，環(huán)列；中央有1分泌道，直徑245～460μm，可見(jiàn)棕黃色分泌物。皮層、髓部均有油細(xì)胞散在；細(xì)小淀粉粒可見(jiàn)(見(jiàn)圖1)。

2.2.2 本品粉末灰綠色 分泌道碎片易見(jiàn)，內(nèi)含細(xì)小顆粒狀分泌物。油細(xì)胞類(lèi)圓形，直徑23～38μm。石細(xì)胞類(lèi)圓形、類(lèi)長(zhǎng)方形，直徑26～79μm，壁孔明顯。非腺毛由1～2個(gè)細(xì)胞組成，長(zhǎng)42～87μm。纖維、螺紋導(dǎo)管或梯紋易見(jiàn)(見(jiàn)圖2)。

2.3 薄層色譜鑒別 根據(jù)假蒟所含有化學(xué)成分的類(lèi)型，對(duì)不同的提取方法、展開(kāi)系統(tǒng)及顯色劑進(jìn)行反復(fù)考察，穩(wěn)定的薄層鑒別方法如下：取本品粉末1g，加甲醇20ml，加熱回流1h，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取假蒟對(duì)照藥材1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取α-細(xì)辛腦對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-丙酮(20:3)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%的磷鉬酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)(見(jiàn)圖3)。

2.4 檢查

2.4.1 水分 照中國(guó)藥典2010年版一部附錄水分測(cè)定法(附錄IX H第二法)甲苯法測(cè)定，15批假蒟水分測(cè)定結(jié)果為 8.1%～12.0%(見(jiàn)表2)。初步擬定假蒟水分含量不得超過(guò)13.0%。

2.4.2 總灰分 照中國(guó)藥典2010年版一部附錄灰分測(cè)定法(附錄IX K)測(cè)定，15批假蒟總灰分測(cè)定結(jié)果為 11.0%～16.0%(見(jiàn)表2)。初步擬定假蒟總灰分含量不得超過(guò)17.0%。

2.4.3 酸不溶性灰分 照中國(guó)藥典2010年版一部附錄灰分測(cè)定法(附錄IX K)測(cè)定，15批假蒟酸不溶性灰分測(cè)定結(jié)果為 0.4%～3.1%(見(jiàn)表2)。初步擬定假蒟酸不溶性灰分含量不得超過(guò)3.7%。

2.5 浸出物 照水溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的冷浸法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄X A)測(cè)定，15批假蒟水溶性浸出物測(cè)定結(jié)果為 18.6%～28.2%(見(jiàn)表2)。初步擬定假蒟浸出物含量不得少于15.0%。

2.6 α-細(xì)辛腦的含量測(cè)定 α-細(xì)辛腦為假蒟的主要成分，在其揮發(fā)油含量中含量高達(dá)40.33%[5]，對(duì)本品中α-細(xì)辛腦進(jìn)行含量測(cè)定，方法及結(jié)果如下。

2.6.1 色譜條件 采用phenomenex ODS2柱(250mm×4.60 mm,5 μm，)；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸溶液(49∶51)；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)313 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。在上述條件下，各成分無(wú)干擾且完全分離，理論板數(shù)按α-細(xì)辛腦計(jì)算大于1×104，α-細(xì)辛腦對(duì)照品和假蒟供試品色譜圖見(jiàn)圖4。

2.6.2 溶液的制備 取α-細(xì)辛腦對(duì)照品1.95 mg，精密稱(chēng)定，置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成0.195 mg·mL-1的α-細(xì)辛腦對(duì)照品溶液。稱(chēng)取假蒟干燥粗粉0.3 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 ml，回流3 h，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足損失的重量，用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，續(xù)濾液為供試品溶液。

2.6.3 樣品測(cè)定 不同采收時(shí)間采收的假蒟藥材15批，按“2.6.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液各10 μl，按“2.6.1”項(xiàng)條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算α-細(xì)辛腦的含量。假蒟中α-細(xì)辛腦含量在0.036%～0.507%之間(見(jiàn)表2)。

表2 假蒟水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、α-細(xì)辛腦含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.7 指紋圖譜的研究 指紋圖譜能較全面地反映生藥所含內(nèi)在化學(xué)成分的種類(lèi)與數(shù)量，更加有效地體現(xiàn)了生藥成分的復(fù)雜性，因而在評(píng)價(jià)生藥內(nèi)在質(zhì)量方面更客觀，更符合傳統(tǒng)的中醫(yī)藥理論。本文收集了廣西產(chǎn)(桂東、桂南、桂西、桂中)樣品15批，用高效液相色譜法對(duì)假蒟指紋圖譜進(jìn)行研究，結(jié)果如下。

2.7.1 溶液的制備 精密稱(chēng)取α-細(xì)辛腦對(duì)照品4.10mg，置10ml量瓶中，用適量甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.4100mg·ml-1的對(duì)照品溶液。取假蒟藥材干燥粉末約0.3g，精密稱(chēng)定，精密加入50%甲醇20ml稱(chēng)重，回流提取1h，放冷至室溫，加50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液，用微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

2.7.2 色譜條件 采用phenomenex C18ODS2柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈-0. 05%磷酸，梯度洗脫(0～15 min：5%～20% 乙腈；15～25 min：20% 乙腈；25～55 min：20%～47% 乙腈；55～65 min：47%～58% 乙腈；65～70 min：58%～70% 乙腈；70～90 min：70%～85% 乙腈；90～100 min：85%～85% 乙腈)；流速1.0ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)258 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μl。

2.7.3 指紋圖譜與共有峰的確定 按“2.7.2”項(xiàng)方法檢測(cè)15批假蒟藥材的指紋圖譜。將測(cè)試數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)”軟件，經(jīng)校正，將譜峰自動(dòng)匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜；通過(guò)中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件得假蒟HPLC指紋譜共有模式圖(見(jiàn)圖5)。結(jié)果表明，其中有15個(gè)主要色譜峰(占總峰面積90%以上)是15批假蒟藥材所共有的，以峰面積較大且分離度較好的12號(hào)峰(α-細(xì)辛腦)作為參照峰S。

2.7.4 指紋圖譜的相似度分析 將15批藥材樣本圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜比較，計(jì)算相似度。結(jié)果顯示，4批假蒟藥材相似度大于0.70，7批假蒟藥材相似度大于0.80，其余4批假蒟藥材相似度大于0.90。

3 討論

α-細(xì)辛腦為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一[6,7]，具有很好的治療哮喘、毛細(xì)支氣管炎、癲癇、驚厥和降血脂等疾病的作用。假蒟揮發(fā)油的主要成分為α-細(xì)辛腦，含量高達(dá)40.33%[5]，以其作為化學(xué)對(duì)照品進(jìn)行薄層鑒別，具有一定的合理性。中藥材含有多種成分，常共同發(fā)揮臨床療效，有時(shí)甚至具有雙向調(diào)節(jié)作用，很難確定某一化學(xué)成分即是中醫(yī)用藥的唯一有效成分。況且，已有研究表明假蒟中α-細(xì)辛腦會(huì)受產(chǎn)地、采收季節(jié)、加工方法等影響[8-10]，故含量測(cè)定以α-細(xì)辛腦為指標(biāo)，只能間接地控制其質(zhì)量，應(yīng)與浸出物等指標(biāo)聯(lián)合使用。而指紋圖譜的應(yīng)用，較好地克服了單一成分含量測(cè)定的不足。通過(guò)指紋圖譜特征，能有效鑒定樣品的真?zhèn)位虍a(chǎn)地；通過(guò)指紋圖譜主要特征峰的面積或比例的制定，能有效控制樣品的質(zhì)量，確保樣品質(zhì)量的相對(duì)穩(wěn)定。假蒟指紋圖譜的研究，雖然取得了一定成果，但要用于其質(zhì)量監(jiān)控尚需進(jìn)一步完善。

綜上所述，本研究的結(jié)果，可為進(jìn)一步完善假蒟藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]冼寒梅,鄧家剛.廣西臨床常見(jiàn)中草藥[M].南寧:廣西科學(xué)技術(shù)出版社,2007:107.

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[3]廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局.廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S].南寧:廣西科技出版社,2011:270.

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StudyonQualityStandardforZhuangMedicineofPiperSarmentosumRoxb

GUI Zhen-cai1YAN Ping-hua2TANG Yu-rong2GAN Ri-cheng2

1.Pharmacy of the First Affiliated of Guangxi University of Chinese Medicine,Guangxi Province, Nanning 530023, China;2. Guangxi University of Chinese Medicine, Guangxi Province, Nanning 530001, China

ObjectiveStudy on the Quality Standard of Piper sarmentosum Roxb.MethodsIdentification of Piper sarmentosumRoxb.by four classic identification methods, and content of moisture, total ash, acid-insoluble ash and water extract were determined according to the approaches listed in the Chinese pharmacopoeia published in 2010, the content of α-asarone and fingerprint of Piper sarmentosum Roxb. were establish by HPLC.ResultsDetermined the identification,content determination and fingerprint methods for Piper sarmentosum Roxb..ConclusionThe methods provide experimental basis for the quality standard of Piper sarmentosum Roxb.

Piper sarmentosum Roxb.; identification; determination; fingerprint; quality standard

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專(zhuān)項(xiàng)課題(GZKZ10-034),《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(第二卷)》標(biāo)準(zhǔn)研究項(xiàng)目(MZY2010072)。

桂貞才(1963-)，男，廣西扶綏人，主要從事中藥品種、品質(zhì)及資源開(kāi)發(fā)研究。

R29

A

1007-8517(2014)16-0021-04

2014.06.05)