俞 玲,馬暉玲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

當今世界，水資源的匱乏是一個普遍性的問題，尤其在西北地區(qū)顯得更加突出。干旱脅迫是限制草坪草生長的最重要的環(huán)境因子之一[1]，不僅威脅其幼苗的生存,且對后期產(chǎn)量、越冬等都有一定影響[2,3]。因此,研究其抗旱性,對北方地區(qū)草坪的建植、植被恢復以及生態(tài)環(huán)境改善具有重要意義。

內(nèi)源激素是植物體內(nèi)重要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì),與植物抗逆性有著密切的聯(lián)系。逆境條件打破了植物體內(nèi)激素產(chǎn)生和分配的平衡狀況,導致代謝途徑發(fā)生變化,使植物對逆境的適應性與抗性增強[4],很多學者研究發(fā)現(xiàn)，氣孔是對植物激素變化最敏感的部位，并且認為脫落酸(ABA)[5]和細胞激動素(CTK)[6]的相互作用對氣孔開閉產(chǎn)生影響進而增加其對干旱的適應性。Lu等[7]研究證明在干旱脅迫下,小麥葉片中ABA含量升高,并且抗旱品種積累的ABA較多。目前,對優(yōu)良抗旱草坪草草地早熟禾的選育成為研究熱點，有關(guān)干旱脅迫下草地早熟禾生理指標的變化報道的很多[8-10]，而對草地早熟禾內(nèi)源激素的動態(tài)變化研究還較少。因此，以甘肅省野生草地早熟禾為材料，采用高效液相色譜法，就不同草地早熟禾材料在干旱脅迫下ABA，IAA和ZT 3種內(nèi)源激素的動態(tài)變化進行分析，探討草地早熟禾對干旱脅迫的響應機制，以期為草地早熟禾抗旱性的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料和試驗儀器

安定(AD)和西和(XH)野生草地早熟禾種子分別采自甘肅省定西市安定區(qū)、隴南市西和縣。

試驗采用Agilent 1100 Series液相色譜儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、VWD檢測器、紫外分光光度計、0.22 μm有機系針頭過濾器。ZT標樣購自蘭州中瑞實驗耗材經(jīng)營部國產(chǎn)分裝產(chǎn)品；IAA和ABA標樣購自蘭州科邁實驗耗材經(jīng)營部國產(chǎn)分裝產(chǎn)品；甲醇、石油醚為色譜純；其他試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗在甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院培養(yǎng)室進行，2013年4月5日將野生草地早熟禾成熟種子播于直徑18 cm的花盆，種植基質(zhì)為土壤、有機質(zhì)、砂子按7∶2∶1組成。試驗設(shè)置對照(CK)和成坪以后進行的干旱處理，即草地早熟禾充分灌水(即達到土壤最大持水量)后不再澆水，令其自然失水，干旱處理以土壤含水量占最大持水量的百分比分為5個梯度：無脅迫(CK，100%)，輕度脅迫(75%～85%)，中度脅迫(55%～65%)，重度脅迫(35%～45%)，嚴重脅迫(15%～25%)，每份材料3個重復，當土壤含水量在設(shè)定的梯度范圍時，采取葉片進行測量，每天早上8∶30補充前一天失去的水分，使各處理在采樣時達到設(shè)定的含水量。

1.2.2 樣品處理及HPLC分析 稱取新鮮葉片1 g，加入10 mL預冷的80%甲醇，液氮研磨至勻漿。密封置冰箱4 ℃，浸提24 h，5 000 r/min離心15 min，取上清液，殘渣再加入5 mL 80%的冷甲醇溶液避光數(shù)小時，相同條件離心10 min，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀35 ℃蒸至原體積的1/2。經(jīng)C18膠柱分離純化后，氮氣吹干，流動相定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm有機系針頭過濾，取20 μL進行色譜分析。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：采用Eclipse XDB-C8柱(4.6 mm×150 mm,5 um)；流速：1 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL；流動相按甲醇∶0.6%冰乙酸(45∶55)為基準前后變化進行摸索，柱溫設(shè)置25 ℃和35 ℃兩個溫度，進行比較。最后以激素徹底分離，峰形好來選擇出最佳的流動相和柱溫。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用Excel進行數(shù)據(jù)整理，Spass 19.0進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動相的選擇 采用甲醇和水作為流動相時，3種激素分離不完全，且色譜圖拖尾現(xiàn)象嚴重，峰形不好。冰乙酸可以抑制樣品的電離、改善拖尾現(xiàn)象，因此，在流動相中加入0.6%冰乙酸。試驗就流動相中甲醇和冰乙酸的體積比進行分析比較，結(jié)果表明，當甲醇與0.6%冰乙酸體積比>45∶55時，各激素能完全分開，但色譜峰分離度較??；當體積比<45∶55時，激素靈敏度下降、保留時間迅速增加，且易對色譜柱的填充物造成損害；當體積比為45∶55時，各個激素分離徹底、峰形好，無拖尾現(xiàn)象。故選擇甲醇∶0.6%的冰乙酸為45∶55的流動相。

2.1.2 柱溫的選擇 柱溫對不同激素色譜峰之間的分離有顯著的影響。因此,設(shè)定25 ℃和35 ℃ 2個梯度，對不同柱溫下IAA，ZT和ABA之間的分離效果進行了研究，試驗表明在25 ℃柱溫下分離效果最佳。

2.2 干旱脅迫下野生草地早熟禾葉片內(nèi)源激素的動態(tài)變化

2.2.1 干旱脅迫下草地早熟禾葉片ZT含量變化 干旱脅迫促使草地早熟禾ZT含量顯著下降，但變化幅度因種質(zhì)材料的不同而不同。輕度(75%～85%)、中度(55%～65%)和重度脅迫(35%～45%)下，AD和XH葉片ZT含量較對照均顯著下降。嚴重脅迫下(15%～25%)，AD和XH葉片ZT含量繼續(xù)下降至最低，分別為62.28、63.42 ng/g。干旱脅迫使AD葉片ZT的含量下降幅度最大，與對照相比，下降了62.45%(圖1)。

圖1 草地早熟禾葉片ZT含量Fig.1 Changes of ZT in leaves of indigenous

2.2.2 干旱脅迫下草地早熟禾葉片IAA含量變化 干旱脅迫下，草地早熟禾葉片IAA含量變化趨勢相同，均先上升后下降。輕度脅迫(75%～85%)促進IAA含量的增加，其增加幅度存在差異，XH葉片IAA含量達到峰值，為690.84 ng/g，但明顯低于AD；中度脅迫(55%～65%)下，XH葉片IAA含量下降而AD葉片IAA含量繼續(xù)上升至峰值，為796.36 ng/g。隨著脅迫程度的繼續(xù)加大，AD和XH葉片的IAA含量均下降。脅迫末期，IAA含量均降至最低，分別為374.40、310.94 ng/g(圖2)。

2.2.3 干旱脅迫下草地早熟禾葉片ABA含量變化 干旱脅迫促進ABA含量的積累。輕度脅迫下(75%～85%)，ABA含量較對照顯著增加；中度脅迫下(55%～65%)，ABA含量變化存在明顯差異，其中，XH葉片ABA含量顯著降低，而AD葉片ABA含量繼續(xù)增加并且達到峰值為443.98 ng/g；重度脅迫下(35%～45%)，ABA含量均下降，其中，XH葉片ABA含量降至最低；嚴重脅迫下(15%～25%)，AD葉片ABA含量下降，而XH葉片ABA含量略微上升，但均顯著高于對照，干旱脅迫使AD葉片ABA含量增加幅度最大，為73.95%(圖3)。

圖2 草地早熟禾葉片IAA含量Fig.2 Changes of IAA in leaves of indigenous bluegrass

2.2.4 干旱脅迫下草地早熟禾葉片ZT/ABA,ZT/IAA和(ZT+IAA)/ABA變化 干旱脅迫下， ZT/ABA和(ZT+IAA)/ABA總體呈下降趨勢，ZT/IAA先下降后上升，但較對照顯著下降(表1)。其中ZT/ABA下降幅度最大，在70.69%～77.94%；其次為(ZT+IAA)/ABA，下降幅度為64.85%～70.29%；下降幅度最小的是ZT/IAA，在20.00%～29.17%。

圖3 草地早熟禾葉片ABA含量Fig.3 Changes of ABA in leaves of indigenous bluegrass

脅迫期間，ZT/ABA、ZT/IAA和(ZT+IAA)/ABA變化幅度因脅迫程度的不同而不同。其中輕度(75%～85%)和中度(55%～65%)脅迫下，三者下降幅度最大，顯著低于對照。重度脅迫(35%～45%)下，(ZT+IAA)/ABA和ZT/ABA繼續(xù)下降，和中度脅迫相比，均差異顯著。嚴重脅迫下，(ZT+IAA)/ABA和ZT/ABA繼續(xù)下降至最低，與重度相比，前者差異顯著，后者無顯著性差異。整個脅迫期間，AD葉片ZT/ABA、ZT/IAA和(ZT+IAA)/ABA下降幅度最大。

表1 草地早熟禾葉片ZT/ABA,ZT/IAA和(ZT+IAA)/ABATable 1 Changes of ZT/ABA,ZT/IAA and (ZT+IAA)/ABA in leaves of indigenous bluegrass

3 討論與結(jié)論

3.1 干旱脅迫對草地早熟禾葉片內(nèi)源激素含量的影響

3.1.1 干旱脅迫對葉片ZT含量的影響 ZT是植物體內(nèi)最常見的細胞分裂素,其促進細胞分裂、擴大，側(cè)芽發(fā)育，還促進營養(yǎng)物質(zhì)移動和延遲衰老[11]，與植物抗逆性密切相關(guān)。水分脅迫期間ZT含量的降低，有利于植物保持較高的水分，是一種保護性的生理反應[12]。脅迫期間葉片ZT含量降低，導致植株生長速率減慢,從而緩解了干旱造成的壓力?？购的芰υ綇姡陨碚{(diào)節(jié)能力就越大，即水分脅迫下ZT的合成越少[4]。脅迫期間安定野生草地早熟禾葉片ZT含量下降最明顯，脅迫末期ZT含量只有對照的37.55%，說明安定野生草地早熟禾對干旱的耐受性較強。

3.1.2 干旱脅迫對葉片IAA含量的影響 試驗研究中水分脅迫初期，IAA含量呈上升趨勢，表明輕度干旱不足以對草地早熟禾的生長構(gòu)成威脅，此時植物仍在生長，隨脅迫程度的繼續(xù)增加，IAA含量下降，可能是因為重度脅迫下，IAA的合成部位受損，無法繼續(xù)合成IAA，植物通過抑制自身的生長來抵御干旱，總體而言，干旱脅迫下IAA含量與對照相比顯著下降，這與Wang等[13]的研究結(jié)果一致。然而，在茶樹和棉花等[14-17]研究中，干旱脅迫促進了IAA的積累，有關(guān)水分狀況和內(nèi)源IAA水平之間的關(guān)系，迄今為止還有爭議，其內(nèi)在機制尚需深入研究[18]。

3.1.3 干旱脅迫對葉片ABA含量的影響 ABA作為一種信號傳導因子，主要由根產(chǎn)生,能夠促進休眠、抑制生長、還可以促進氣孔關(guān)閉和促進根系水分吸收[18，19]。輕度和中度干旱脅迫下，ABA含量積累較多，說明其在逆境下對環(huán)境變化的潛在適應性較強，然而這種適應性是有限度的，隨著脅迫程度的繼續(xù)加重，這種自我保護的機制會遭到破壞，從而使ABA含量下降?？傮w分析，草地早熟禾葉片ABA含量，均隨脅迫程度的增加，呈上升趨勢，趙文魁等[19]研究也得到了相似的結(jié)論，ABA能夠增加植物根部的水分吸收，促使葉片氣孔開度受抑或關(guān)閉，水分蒸騰減少，最終植物的保水能力提高。

很多學者認為，品種的抗旱性與ABA的積累密切相關(guān)，抗旱性越強，ABA含量增加速度越快，積累能力越強[18,20]，干旱脅迫下，安定野生草地早熟禾葉片ABA含量增加幅度最大，比對照增加了73.95%，初步推測安定野生草地早熟禾抗旱性強于西和野生草地早熟禾，然而ABA的積累又會引起葉片脫落，加速植株衰老。因此,干旱脅迫下植物體內(nèi)積累的ABA并不是越多越好，此次試驗ABA含量在脅迫后期下降正好說明這一點。

3.1.4 干旱脅迫對草地早熟禾葉片ZT/ABA,ZT/IAA,(ZT+IAA)/ABA的影響 隨著干旱脅迫強度的增加，安定和西和野生草地早熟禾葉片的ZT/ABA、ZT/IAA和(ZT+IAA)/ABA呈下降趨勢，這3種激素相互抑制，相互促進，共同參與了代謝平衡，干旱脅迫期間，IAA，ZT和ABA的變化總是向著促進氣孔關(guān)閉，減緩生長發(fā)育，維持細胞膨壓的方向代謝，以便植物最優(yōu)化地利用有限水分，這在很多研究中得到了證明[21，22]。安定野生草地早熟禾葉片的ZT/ABA，ZT/IAA和(ZT+IAA)/ABA下降幅度大于西和野生草地早熟禾，表明其應對干旱脅迫的能力強于后者。

參考文獻:

[1] 鄒琦.植物生理學實驗指導[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2000.

[2] 黎裕.作物抗旱鑒定方法與指標[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,1993,11(1):91-98.

[3] 李智念,王光明,曾之文.植物干旱脅迫中的ABA研究[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2003,21(2):99-104.

[4] 孫志勇,季孔庶.干旱脅迫對雜交鵝掌楸無性系葉片內(nèi)源激素含量的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2010,38(31):17362-17364.

[5] Davies P J.Hormones as regulators of water balance[M]∥Davies S T.plant hormones and their role in plant growth and development.Martinus Nijhoff Pubilishers,1987：411-430.

[6] Luke H H,Freeman T E.Stimulation of transpiration by cytokinins [J].Nature,1968,217:873-874.

[7] Lu D B,Paulsen G M.Increasing stress resistance by in vitro selection for abscisic acid insensitively in wheat[J].Crop science,1989,29(4):939-943.

[8] 溫洋,孫吉雄,王代軍.干旱脅迫對冷地型草坪草生理特性影響的研究[J].草原與草坪,2005(1)：43-45.

[9] 段碧華,尹偉倫,韓寶平,等.模擬干旱脅迫下幾種冷季型草坪草抗旱性比較研究[J].草原與草坪,2005(5):38-41.

[10] 李顯利,米福貴,閆立軍,等.草地早熟禾不同品種抗旱性的評價分析[J].草原與草坪,2010,30(3):43-46.

[11] 李源,王贊,劉貴波,等.干旱脅迫下膠質(zhì)苜蓿內(nèi)源激素及解剖結(jié)構(gòu)的研究[J].華北農(nóng)學報,2010,25(6):211-216.

[12] 潘根生,吳伯千,沈生榮,等.水分脅迫過程中茶樹新稍內(nèi)源激素水平的消長及其與耐旱性的關(guān)系[J].中國農(nóng)業(yè)科學,1996,29(5):9-15.

[13] Wang C h R,Yang A F,Yin H Y.Influence of water stress on endogenous hormone concentrations and cell damage of maize seedlings[J].Integrative Plant Biology,2008,50:427-434.

[14] 潘根生,錢利生,吳伯千,等.茶樹新梢生育的內(nèi)源激素水平及其調(diào)控機理(第三報)干旱脅迫對茶樹內(nèi)源激素的影響[J].茶葉,2001,27(1):35-38.

[15] 李東曉,李存東,孫傳范,等.干旱對棉花主莖葉片內(nèi)源激素含量與平衡的影響[J].棉花學報,2010,22(3):231-235.

[16] 沈法富,喻樹迅,范術(shù)麗,等.不同短季棉品種生育進程中主莖葉內(nèi)源激素的變化動態(tài)[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2003,36(9):1014-1019.

[17] 田曉莉,楊培珠,何鐘佩,等.棉花根冠關(guān)系的研究根系傷流液及葉片內(nèi)源激素的變化[J].中國農(nóng)業(yè)大學學報,1999,4(5):92-97.

[18] 何衛(wèi)軍,焦旭亮,張振文,等.不同干旱脅迫水平下赤霞珠和黑比諾幼苗內(nèi)源激素水平比較[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2008,26(3):142-145.

[19] 趙文魁,童建華,張雪芹，等.干旱脅迫下幾種柑桔植物內(nèi)源激素含量的變化規(guī)律[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù),2007,27(4):55-59.

[20] 陳立松,劉星輝.水分脅迫對荔枝葉片內(nèi)源激素含量的影響[J].熱帶作物學報,1999(9):31-35.

[21] Tawainga K.Tillage and rotation effects on soil physical characteristics [J].Agronomy Journal,2002,94:299-304.

[22] Monneveux P,Belhassen E.The diversity of drought adaptation in the wild[J].Plant Growth Regulation,1996,20:85-92.