徐曉紅+劉桂英+宋廣軍+吳金浩+王年斌

摘要：利用藻類在線分析儀測(cè)定了3種不同微藻（鹽藻、角毛藻、金藻）的熒光值，同時(shí)采用經(jīng)典方法同步測(cè)定葉綠素a濃度和細(xì)胞密度。分析結(jié)果顯示，熒光值與葉綠素a濃度、細(xì)胞密度具有顯著的正相關(guān)關(guān)系。因此，利用藻類在線分析儀能夠反映海水中微生物量的變化，也能夠反映海水中葉綠素a濃度的變化。藻類在線分析儀的應(yīng)用，能夠及時(shí)掌握海水中生態(tài)環(huán)境的變化，為海域自然災(zāi)害的預(yù)警提供有力的科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：微藻；在線監(jiān)測(cè)；葉綠素a；細(xì)胞密度

微藻生物量的測(cè)定是藻類生理生態(tài)學(xué)研究中的常規(guī)測(cè)定指標(biāo)，微藻的濃度對(duì)于預(yù)測(cè)有害海藻的暴發(fā)和間接測(cè)量水樣中富營養(yǎng)化程度具有重要的作用。實(shí)驗(yàn)室常用分析微藻生物量的方法很多，包括干重測(cè)定法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法、濁度法、葉綠素a含量測(cè)定法等［1］。葉綠素a含量測(cè)定法基本采用分光光度法［2］，主要是利用分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素a的含量，采用有機(jī)溶劑丙酮作為提取溶液。細(xì)胞計(jì)數(shù)法能夠反應(yīng)微藻的生長情況，但是工作量大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且重現(xiàn)性較差［3］。無論是細(xì)胞計(jì)數(shù)法還是葉綠素含量測(cè)定法，均操作繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間長，且不適用于連續(xù)監(jiān)測(cè)，不能獲得海水環(huán)境監(jiān)測(cè)的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，而藻類在線分析儀監(jiān)測(cè)是基于現(xiàn)場(chǎng)結(jié)果，能夠獲取實(shí)時(shí)的連續(xù)的數(shù)據(jù)，對(duì)水體中的環(huán)境狀況及時(shí)作出判斷，為海域?yàn)?zāi)害性事故-赤潮的預(yù)警和政府部門的綜合決策提供科學(xué)的依據(jù)。

本文對(duì)藻類在線分析儀測(cè)得的葉綠素?zé)晒庵蹬c葉綠素濃a濃度、細(xì)胞密度相關(guān)性進(jìn)行研究，確定藻類在線分析儀對(duì)海域水質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù)監(jiān)測(cè)，能夠反映出某海域生態(tài)環(huán)境變化狀況，對(duì)赤潮早期預(yù)報(bào)提供有力的科學(xué)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

選取鹽藻、角毛藻、金藻作為樣品溶液，由遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)院袁成玉研究員提供；自然海水從黑石礁附近海域采集。AOM藻類在線分析儀（捷克），751型分光光度計(jì)，TDZ-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)，ZYS-200E光學(xué)顯微鏡。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

利用蒸餾水將鹽藻稀釋成7個(gè)濃度梯度，使葉綠素a濃度在0～200 μg/L之間，分別測(cè)定其葉綠素?zé)晒庵?、?xì)胞密度和葉綠素a的含量，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.1葉綠素?zé)晒庵道肁OM藻類在線分析儀測(cè)定，通過流過式檢測(cè)得到葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

1.2.2細(xì)胞密度藻類樣品用具5%甲醛固定保存，樣品經(jīng)過靜置、沉淀，處理后樣品使用光學(xué)顯微鏡采用個(gè)體計(jì)數(shù)法進(jìn)行種類鑒定和數(shù)量統(tǒng)計(jì)，計(jì)算細(xì)胞密度。

1.2.3葉綠素a含量采用分光光度法［4］測(cè)定在一定壓力下，用醋酸纖維酯微孔濾膜（孔徑為0.45 μm）對(duì)100 mL的藻液過濾，加入1 mL的碳酸鎂懸浮液，然后將濾膜折疊放入10 mL具塞離心管中，加入90%的丙酮10 mL，充分振蕩，使其溶解均勻，放置在4 ℃冰箱內(nèi)提取24 h，然后用離心機(jī)在4 500 r/min下離心10 min，提取上清液于1 cm比色皿中，在波長為664，647，630和750 nm處用分光光度計(jì)測(cè)其吸光值，采用750 nm的吸光值用以校正提取液的濁度，其中以90%丙酮溶液作為參比，按Jeffrey Humphrey 的方程式得出葉綠素a的含量。

ρchl-a＝（11.85E664-1.54E647-008E630）×ｖ/（V×L）

ρchl-a——樣品中葉綠素a含量， μg/L

ｖ——樣品提取液的體積，mL

V——藻液實(shí)際用量，L

L——測(cè)定池光程，cm

2結(jié)果與分析

2.1儀器穩(wěn)定性

開啟藻類在線分析儀，待儀器穩(wěn)定之后，連續(xù)檢測(cè)同一自然海水6次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為373%，多次檢測(cè)同一樣品，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在5%以下，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差越小，說明儀器越穩(wěn)定。

在波長為590 nm的條件下，分別對(duì)鹽藻溶液稀釋2倍和4倍的樣品進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果如圖1和圖2所示，表明儀器對(duì)不同濃度的鹽藻有不同的信號(hào)響應(yīng)。

圖1590 nm下不同濃度鹽藻熒光強(qiáng)度

圖2590 nm測(cè)量光連續(xù)監(jiān)測(cè)不同濃度鹽藻的生物量

2.2靈敏度

對(duì)蒸餾水配制的標(biāo)準(zhǔn)藻類逐級(jí)稀釋，得到儀器與葉綠素a濃度（細(xì)胞密度）的最小響應(yīng)值，確定藻類在線分析儀的檢出限。葉綠素a含量的最小檢出限濃度為30 ng/L，藻類的最小檢出限為10 cells/mL。

2.3相關(guān)性分析

2.3.1微藻葉綠素?zé)晒庵蹬c細(xì)胞密度的相關(guān)性對(duì)鹽藻的葉綠素?zé)晒庵岛图?xì)胞密度之間進(jìn)行線性回歸分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，處于對(duì)數(shù)生長期的鹽藻的葉綠素?zé)晒庵蹬c細(xì)胞密度具有良好的相關(guān)性，得到直線回歸方程，Y＝0.182 4 X＋255.27，相關(guān)系數(shù)為0.986 9(見圖3)。

2.3.2微藻葉綠素?zé)晒庵蹬c葉綠素a含量的相關(guān)性對(duì)鹽藻的葉綠素?zé)晒庵岛腿~綠素a之間進(jìn)行線性回歸分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，處于對(duì)數(shù)生長期的鹽藻的葉綠素?zé)晒庵蹬c葉綠素a含量具有良好的相關(guān)性，得到直線回歸方程，Y＝104.79 X＋128.71，相關(guān)系數(shù)為0.999 1(見圖4)。

2.3.3微藻葉綠素a含量與細(xì)胞密度的相關(guān)性對(duì)鹽藻的葉綠素a含量和細(xì)胞密度之間進(jìn)行線性回歸分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，處于對(duì)數(shù)生長期的鹽藻的葉綠素a含量與細(xì)胞密度具有良好的相關(guān)性，得到直線回歸方程，Y＝0.014 9 X＋2.155 5，相關(guān)系數(shù)為0.993 1(見圖5)。

圖3熒光值與細(xì)胞密度的關(guān)系圖

圖4葉綠素?zé)晒庵蹬c葉綠素a濃度的關(guān)系

圖5細(xì)胞密度與葉綠素a濃度的關(guān)系

2.4野外監(jiān)測(cè)

藻類在線分析儀在凌水灣的監(jiān)測(cè)結(jié)果如圖6所示，表明大連凌水灣水域24 h內(nèi)微藻含量基本一致，變化趨勢(shì)不明顯。利用顯微鏡進(jìn)行鑒定，本海域主要藻類為中肋骨條藻、圓篩藻等。

圖6藻類在線分析儀在凌水灣的監(jiān)測(cè)結(jié)果

3討論

AOM藻類在線分析儀靈敏度高，穩(wěn)定性好，所測(cè)葉綠素?zé)晒庵蹬c葉綠素a的含量具有正相關(guān)關(guān)系，與生物量具有正相關(guān)關(guān)系，能夠反映某海域生物量和葉綠素的變化趨勢(shì)。

藻類在線分析儀雖然能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，操作簡單，但是由于監(jiān)測(cè)原理和本身構(gòu)造的缺陷，有其不足之處。首先，傳感器直接檢測(cè)的是海水中所有物種在藍(lán)光（中心波長470 nm）或者紅光（590 nm）的照射下發(fā)出的熒光。在一般情況下，大多數(shù)的熒光是由浮游植物中的葉綠素引起的，但是，存在于海水中并發(fā)熒光的物質(zhì)均會(huì)被檢測(cè)〖LL〗到。因此，藻類在線分析儀是對(duì)所有的熒光物質(zhì)進(jìn)行定量卻不能定性，如果針對(duì)某個(gè)藻類產(chǎn)生的葉綠素，使用該儀器進(jìn)行的葉綠素測(cè)定的準(zhǔn)確度比實(shí)驗(yàn)室單個(gè)樣品分析的準(zhǔn)確度差。其次，如果為了獲得準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，需要定期地對(duì)傳感器進(jìn)行校準(zhǔn)。如果要保證所測(cè)定的是真實(shí)存在于海水中葉綠素的成份，那么只能通過實(shí)驗(yàn)室萃取分析海水中葉綠素的濃度，然后用該濃度對(duì)傳感器檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn)。即使用實(shí)驗(yàn)室方法測(cè)定的樣品葉綠素值對(duì)傳感器進(jìn)行了校正，數(shù)據(jù)也不是很準(zhǔn)確。因此，藻類在線分析儀主要用來檢測(cè)海水中葉綠素的變化趨勢(shì)，掌握海洋環(huán)境整體的變化情況。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 沈萍萍，王朝暉，齊雨藻，等.光密度法測(cè)定微藻生物量［J］.?暨南大學(xué)學(xué)報(bào)，2001,22(3): 115-119

［2］ 蘇正淑，張憲政.幾種測(cè)定植物葉綠素含量的方法比較［J］.?植物生理學(xué)通訊，1989（5）: 77-78

［3］ 董正臻，董振芳，丁德文.快速測(cè)定藻類生物量的方法探討［J］.?海洋科學(xué)，2004,28(11): 1-5

［4］ GB17378.7-2007，《葉綠素-a的測(cè)定 分光光度法》海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范 第7部分：近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測(cè)［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007

The application of algae online analyzer on marine pollution

XU Xiaohong， LIU Guiying，SONG Guangjun，WU Jinhao，WANG Nianbin

（1.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute，Liaoning Dalian 116023；2. Liaoning Ocean Environment Monitoring Station， Dalian 116023）

Abstract：The fluorescent value of three microalgaes including Dunaliella salina，Chaetoceros，Chrysophyta were deter mined by algae online analyser. Compared with cell density and chlorophyll-a content, it showed good linear interrelation. So, algae online analyser can reflect the variety of microalgal biomass and chlorophyll-a content from sea water. The application of algae online analyzer can know ecology enviro nment change, which supply scientific evidence for natural disaster area warning.

Key words：microalgaes,online survey, chlorophyll-a, cell density

［2］ 蘇正淑，張憲政.幾種測(cè)定植物葉綠素含量的方法比較［J］.?植物生理學(xué)通訊，1989（5）: 77-78

［3］ 董正臻，董振芳，丁德文.快速測(cè)定藻類生物量的方法探討［J］.?海洋科學(xué)，2004,28(11): 1-5

［4］ GB17378.7-2007，《葉綠素-a的測(cè)定 分光光度法》海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范 第7部分：近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測(cè)［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007

The application of algae online analyzer on marine pollution

XU Xiaohong， LIU Guiying，SONG Guangjun，WU Jinhao，WANG Nianbin

（1.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute，Liaoning Dalian 116023；2. Liaoning Ocean Environment Monitoring Station， Dalian 116023）

Abstract：The fluorescent value of three microalgaes including Dunaliella salina，Chaetoceros，Chrysophyta were deter mined by algae online analyser. Compared with cell density and chlorophyll-a content, it showed good linear interrelation. So, algae online analyser can reflect the variety of microalgal biomass and chlorophyll-a content from sea water. The application of algae online analyzer can know ecology enviro nment change, which supply scientific evidence for natural disaster area warning.

Key words：microalgaes,online survey, chlorophyll-a, cell density

［2］ 蘇正淑，張憲政.幾種測(cè)定植物葉綠素含量的方法比較［J］.?植物生理學(xué)通訊，1989（5）: 77-78

［3］ 董正臻，董振芳，丁德文.快速測(cè)定藻類生物量的方法探討［J］.?海洋科學(xué)，2004,28(11): 1-5

［4］ GB17378.7-2007，《葉綠素-a的測(cè)定 分光光度法》海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范 第7部分：近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測(cè)［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007

The application of algae online analyzer on marine pollution

XU Xiaohong， LIU Guiying，SONG Guangjun，WU Jinhao，WANG Nianbin

（1.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute，Liaoning Dalian 116023；2. Liaoning Ocean Environment Monitoring Station， Dalian 116023）

Abstract：The fluorescent value of three microalgaes including Dunaliella salina，Chaetoceros，Chrysophyta were deter mined by algae online analyser. Compared with cell density and chlorophyll-a content, it showed good linear interrelation. So, algae online analyser can reflect the variety of microalgal biomass and chlorophyll-a content from sea water. The application of algae online analyzer can know ecology enviro nment change, which supply scientific evidence for natural disaster area warning.

Key words：microalgaes,online survey, chlorophyll-a, cell density