曹瓊+倪超超

摘要:蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前全球應(yīng)用最成功的生物殺蟲(chóng)劑之一。然而近10 年多的研究成果表明,一直以來(lái)人們認(rèn)為對(duì)人畜無(wú)毒性的蘇云金芽孢桿菌的安全性問(wèn)題受到質(zhì)疑,一些專(zhuān)家認(rèn)為有必要通過(guò)現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)蘇云金芽孢桿菌進(jìn)一步改良,重新選育一些安全性更可靠、殺蟲(chóng)效率更高的Bt菌株應(yīng)用于生物防治,以避免其對(duì)人畜的可能毒害。

關(guān)鍵詞:蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt);生物防治;安全性;遺傳改良;活性成分

中圖分類(lèi)號(hào):S476.1;Q936文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2014)11-2485-05

Advances on the Safety of Biological Control with Bacillus thuringiensis

CAO Qiong1,NI Chao-chao2

(1. Wuhan City Vocational College, Wuhan 430064, China;

2.Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China)

Abstract: Bacillus thuringiensis is one of the most successful biological insecticides applied so far in the world. However, some reports in the past ten years showed that people doubted the safety of Bacillus thuringiensis, which was considered non-toxic to human and animals. Some experts thought that it was necessary to develop new Bt strains with better safety and efficiency with modern biological technology to avoid potential toxicity to human and animals.

Key words: Bacillus thuringiensis; biological control; safety; genetic improvement; active ingredient

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,簡(jiǎn)稱(chēng) Bt)是一類(lèi)能引起昆蟲(chóng)致病的病原菌,1901年首次發(fā)現(xiàn)于日本,1938年作為生物殺蟲(chóng)劑成為商品。自20世紀(jì)50年代Bt商品工業(yè)化以來(lái),就以其高效安全、對(duì)人畜沒(méi)有毒性、能特異殺滅目標(biāo)害蟲(chóng)、對(duì)自然環(huán)境也不造成污染而成為全球應(yīng)用最成功的生物殺蟲(chóng)劑之一,也是目前研究最深入的生物殺蟲(chóng)劑。

目前Bt作為應(yīng)用總量最大的生物殺蟲(chóng)劑,卻只占農(nóng)藥總用量的2%~3%,這距離世界環(huán)境與發(fā)展大會(huì)確定的到2015年生物農(nóng)藥的使用將占農(nóng)藥總用量50%以上的要求還相差甚遠(yuǎn),因此提升Bt生物農(nóng)藥的應(yīng)用安全性和殺蟲(chóng)功效仍然具有深遠(yuǎn)的意義和研究?jī)r(jià)值。

1Bt的特性

蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus,Bc)、蘇云金芽孢桿菌、覃狀芽孢桿菌(Bacillus mycoides,Bm)、假真菌樣芽孢桿菌(Bacillus pseudomycoides,Bp)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis,Ba)以及韋氏芽孢桿菌(Bacillus weihenstephanensis,Bw)全部歸類(lèi)于蠟狀芽孢桿菌群。

Bt是一種在自然界廣泛分布的好氣性芽孢桿菌,在昆蟲(chóng)、土壤、儲(chǔ)藏品及其塵埃、污水和植被上都有分布,革蘭氏染色陽(yáng)性。其細(xì)胞長(zhǎng)度不到0.005 mm,當(dāng)它生長(zhǎng)到一定階段,細(xì)胞一端會(huì)形成一個(gè)卵圓形的芽孢,用來(lái)繁殖后代,另一端會(huì)形成一個(gè)菱形或近似正方體的結(jié)晶體,因?yàn)榕c芽孢相伴而生被稱(chēng)為伴孢晶體,也稱(chēng)δ-內(nèi)毒素[1],是一種或多種殺蟲(chóng)晶體蛋白(Insecticidal crystal proteins,簡(jiǎn)稱(chēng)ICPs),有很強(qiáng)的殺蟲(chóng)毒性。

Bt的生活史為芽孢萌發(fā)-營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)-內(nèi)部形成芽孢和伴孢晶體-芽孢囊破裂釋放出芽孢和伴孢晶體等過(guò)程。

2Bt的活性成分

大量的研究使人們認(rèn)識(shí)了越來(lái)越多的Bt的活性成分[2],特別是其非殺蟲(chóng)活性成分的逐一發(fā)現(xiàn),使人們對(duì)Bt的認(rèn)識(shí)更進(jìn)一步深入。

Bt的殺蟲(chóng)活性成分有幾丁質(zhì)酶、殺蟲(chóng)晶體蛋白(δ-內(nèi)毒素)、磷酯酶C(α-外毒素)、蘇云金素(β-外毒素)、溶血素、腸毒素、營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白、芽孢等[3]。而雙效菌素、輔助蛋白和自身誘導(dǎo)物抑制蛋白等不具有直接的殺蟲(chóng)活性。其具體分類(lèi)情況如表1所示。

2.1營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白

營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白(VIPs)是一類(lèi)Bt在營(yíng)養(yǎng)期分泌的可溶性新型殺蟲(chóng)蛋白。此殺蟲(chóng)蛋白基因的種類(lèi)僅有VIP3A(a)、VIP3A(b)和VIP-s,目前尚未定位。殺蟲(chóng)機(jī)理與殺蟲(chóng)晶體蛋白基因相似,即通過(guò)與敏感昆蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞受體結(jié)合,使中腸溶解而致死。

2.2幾丁質(zhì)酶

大量研究證明Bt的幾丁質(zhì)酶(Chitinase)本身對(duì)昆蟲(chóng)的毒殺作用并不明顯,但是能增強(qiáng)殺蟲(chóng)晶體蛋白的殺蟲(chóng)作用,原因是昆蟲(chóng)中腸圍食膜(大多數(shù)昆蟲(chóng)中腸內(nèi)壁附著的一層起潤(rùn)滑和保護(hù)作用的半透性黏膜)的主要成分幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì),是昆蟲(chóng)防治病原菌和病毒的屏障,當(dāng)Bt進(jìn)入其中腸后分泌的幾丁質(zhì)酶將圍食膜破壞,然后殺蟲(chóng)晶體蛋白進(jìn)一步作用造成中腸穿孔而導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡。

2.3磷酯酶C

磷酯酶C(Phospholipase C)是一類(lèi)可催化磷酯C3上的磷酯酰鍵的蛋白水解酶,在細(xì)胞代謝和信息傳遞等方面起著重要作用。

Bt的磷酯酶有兩種,一種是磷脂酞膽堿特異的磷脂酶(簡(jiǎn)稱(chēng)PCH),另一種是磷脂酞肌醇特異的磷脂酶(簡(jiǎn)稱(chēng)PIH),都是α-外毒素。

2.4溶血素

溶血素(Hemolysin)是一種潛在的Bt孢外致病因子,其作用是當(dāng)Bt菌株附著到昆蟲(chóng)腸壁細(xì)胞后腸壁潰爛,菌株迅速通過(guò)淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血系統(tǒng),分泌溶血素引起溶血作用,使昆蟲(chóng)患敗血癥而死亡,由于其過(guò)程相對(duì)緩慢,因此具有一定的潛伏性。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多Bt的溶血素種類(lèi),如溶血素Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、BL、溶細(xì)胞素AB和神經(jīng)磷脂酶等,而在Bt中僅發(fā)現(xiàn)了溶血素Ⅱ。

2.5蘇云金素

蘇云金素(Thuringiensin)主要存在于血清型H1的Bt菌株,有H4ac、H5、H7~H12 8種,是一類(lèi)腺嘌呤核苷酸衍生物,能抑制RNA聚合酶活性,在細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)被分泌到細(xì)胞外,都是β-外毒素。

蘇云金素對(duì)蠅類(lèi)有很強(qiáng)的毒力,作用過(guò)程緩慢,作用機(jī)制發(fā)生在昆蟲(chóng)蛻皮和變態(tài)階段,這兩個(gè)階段RNA合成旺盛,蘇云金素通過(guò)抑制RNA聚合酶活性,阻斷DNA的表達(dá),對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物有一定的毒性。

2.6雙效菌素

雙效菌素(Zwitternicin)是一種氨基多元醇類(lèi)廣譜抗生素,蘇云金亞種、庫(kù)斯塔克亞種等17種不同的亞種均能產(chǎn)生雙效菌素。其主要作用是抑制霉菌的生長(zhǎng)繁殖,在霉菌還沒(méi)侵染植物前,噴施雙效菌素可起到預(yù)防植物病害的作用,此外,雙效菌素對(duì)Bt的殺蟲(chóng)活性還具有一定的增效作用。

2.7殺蟲(chóng)晶體蛋白(Insecticidal crystal protein, ICPs)

殺蟲(chóng)晶體蛋白是Bt殺蟲(chóng)的主要毒素成分,又叫δ-內(nèi)毒素[4]。

2.7.1殺蟲(chóng)晶體蛋白的種類(lèi)殺蟲(chóng)晶體蛋白的種類(lèi)繁多,目前已知并命名的有230多種。其中大多數(shù)是Cry蛋白,對(duì)鱗翅目、雙翅目或鞘翅目幼蟲(chóng)有毒;少數(shù)是Cyt蛋白,活體條件下只對(duì)雙翅目幼蟲(chóng)有較弱的毒性,離體條件下具有廣譜性毒性[5]。

用于防治鱗翅目害蟲(chóng)殺蟲(chóng)劑的主要來(lái)自庫(kù)斯塔克亞種(Subsp kurstaki)、蘇云金亞種(Subsp thuring

iensis)和鲇澤亞種(Subsp aizawai)的Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac三個(gè)高毒力晶體蛋白基因,其中Cry1Ac殺蟲(chóng)毒力最強(qiáng),來(lái)自鲇澤亞種;擬步行甲亞種(Subsp. tenebrionis)的殺蟲(chóng)蛋白Cry3A對(duì)鞘翅目馬鈴薯甲蟲(chóng)(Leptinotarsa decenlineata)具有較強(qiáng)的毒力;來(lái)自日本亞種(Subsp japonensis)的Cry8C殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)鞘翅目金龜子類(lèi)幼蟲(chóng)有殺蟲(chóng)毒力;以色列亞種(Subsp istealeosis)的殺蟲(chóng)蛋白至少有Cry4A、Cry4B、Cry11A和Cyt1A四種,能殺死蚊蚋幼蟲(chóng),其中Cry11A的活性最高,除了具有抗雙翅目昆蟲(chóng)活性外,還具有溶解無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物細(xì)胞的活性;1999年日本的Mizuki等[6]發(fā)現(xiàn)了某些沒(méi)有殺蟲(chóng)能力的81kD伴孢晶體蛋白,水解活化后對(duì)體外培養(yǎng)的人類(lèi)白血病T細(xì)胞和人類(lèi)子宮頸癌細(xì)胞具有殺傷能力,該蛋白的基因是Cry31Aal,這是繼發(fā)現(xiàn)以色列亞種后又一個(gè)與醫(yī)學(xué)相關(guān)的基因,有望為抗癌研究的發(fā)展和生物制藥開(kāi)辟新的方向;近年來(lái)發(fā)現(xiàn)了一些與Bt具有一定同源性的殺蟲(chóng)晶體蛋白基因如Cryl8Aal,它與Cry2A具有40%的相似性,來(lái)自金龜子芽孢桿菌(Baoillus popilliae),這是一類(lèi)對(duì)金龜子幼蟲(chóng)專(zhuān)性寄生的細(xì)菌,以后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了Cry18Ba和Cry18Ca。

2.7.2殺蟲(chóng)晶體蛋白的作用過(guò)程和基因定位殺蟲(chóng)晶體蛋白被昆蟲(chóng)取食后,迅速作用于昆蟲(chóng)的中腸,致使腸壁出現(xiàn)微孔,昆蟲(chóng)立刻停止取食,腸道內(nèi)膜很快遭到破壞,Bt菌株穿過(guò)腸道進(jìn)入血淋巴系統(tǒng)和血系統(tǒng),最后昆蟲(chóng)因饑餓和敗血癥而死亡[7,8]。

大量研究證明了編碼殺蟲(chóng)晶體蛋白(ICPs)的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因主要位于大質(zhì)粒上,只有少數(shù)位于染色體上[9,10]。

2.8免疫抑制因子A

Bt的免疫抑制因子A(Immune inhibitor A, InA)是一種能產(chǎn)生免疫反應(yīng),引起生物體致病的酶類(lèi)活性因子,能夠分解寄主產(chǎn)生的抗菌蛋白,通過(guò)消化免疫球蛋白IgG和IgA引起寄主致病作用。

2.9腸毒素

腸毒素(Enterotoxin)是引起食物中毒的致病物質(zhì),是一類(lèi)水溶性蛋白質(zhì),食品中的腸毒素不因熱加工而滅活,對(duì)蛋白酶也有耐性,故在消化道中不易被破壞。

目前已發(fā)現(xiàn)了3種腸毒素:無(wú)溶血腸毒素NHE、溶血腸毒素HBL和枯草桿菌毒素T,只有HBL具有溶血活性。研究證實(shí)Bt的庫(kù)斯塔克亞種和以色列亞種的商業(yè)菌株中含有腸毒素基因并且具有溶血活性,只是目前尚未見(jiàn)腸毒素影響人類(lèi)健康的報(bào)道。

2.10輔助蛋白

輔助蛋白(Help protein)能促進(jìn)殺蟲(chóng)晶體蛋白的殺蟲(chóng)作用,也可能是以分子伴侶的形式參與殺蟲(chóng)晶體蛋白的構(gòu)成,對(duì)穩(wěn)定殺蟲(chóng)晶體蛋白的結(jié)構(gòu)有作用。

2.11自身誘導(dǎo)物抑制蛋白

自身誘導(dǎo)物是一類(lèi)存在于植物的病原菌細(xì)胞間傳遞信息的信號(hào)分子,當(dāng)自身誘導(dǎo)物達(dá)到一定濃度時(shí),就能激活病原菌中某些特殊毒素基因的表達(dá),促使病原菌對(duì)植物產(chǎn)生致病作用。

有研究表明,在Bt菌株中存在一種抑制蛋白,能抑制病原菌細(xì)胞內(nèi)的自身誘導(dǎo)物,這種抑制蛋白被稱(chēng)為自身誘導(dǎo)物抑制蛋白。它是一種孢內(nèi)活性成分,影響病原菌致病的作用原理可能是由于降低了病原菌細(xì)胞內(nèi)自身誘導(dǎo)物的濃度,而使自身誘導(dǎo)物達(dá)不到激活某些特殊毒素基因表達(dá)的水平。

2.12芽孢

芽孢是Bt的繁殖結(jié)構(gòu)。很多研究表明,芽孢本身對(duì)昆蟲(chóng)的毒力很低,只有通過(guò)與殺蟲(chóng)晶體蛋白協(xié)同作用才能達(dá)到殺蟲(chóng)效果。芽孢殺蟲(chóng)機(jī)理是在伴孢晶體使中腸潰瘍后,芽孢進(jìn)入血系統(tǒng)萌發(fā)并生長(zhǎng),在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的多種外毒素及酶使幼蟲(chóng)患敗血癥而致死。

3Bt在農(nóng)林業(yè)中的廣泛應(yīng)用

為了減少蟲(chóng)害,確保糧食產(chǎn)量,每年全世界要使用200多萬(wàn)t的化學(xué)農(nóng)藥,金額高達(dá)160億美元。然而,大量使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)帶來(lái)許多憂慮,如生態(tài)平衡的破壞,引起人畜中毒,長(zhǎng)期使用昆蟲(chóng)還會(huì)產(chǎn)生抗藥性,使化學(xué)農(nóng)藥的用量越來(lái)越大等問(wèn)題[11,12]。

與化學(xué)農(nóng)藥相比,生物殺蟲(chóng)劑具有低成本、高效安全、對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)的特異性、對(duì)人畜無(wú)毒性等特性,對(duì)自然界也不造成污染。Bt作為生物殺蟲(chóng)劑應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)已經(jīng)有幾十年的歷史。迄今為止已鑒定了Bt的70個(gè)血清型,83個(gè)亞種,其中我國(guó)發(fā)現(xiàn)41個(gè)血清型。它對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物中的4個(gè)門(mén),線形動(dòng)物門(mén)、原生動(dòng)物門(mén)、扁形動(dòng)物門(mén)中某些有害種類(lèi)和節(jié)肢動(dòng)物中的10個(gè)目(如鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目、直翅目、等翅目、蜚螺目、毛翅目和蚤目等)的近600多種昆蟲(chóng)有特異活性。

我國(guó)研究和應(yīng)用Bt始于1959年;1965年進(jìn)行了工業(yè)化生產(chǎn);自20世紀(jì)80年代以來(lái),我國(guó)Bt規(guī)模進(jìn)一步擴(kuò)大,目前已經(jīng)成為主要的生物殺蟲(chóng)劑[11]。我國(guó)對(duì)Bt有敏感特異的昆蟲(chóng)在125種以上。

4Bt的安全性分析和遺傳改良

4.1Bt的安全性分析

4.1.1對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的影響B(tài)t的廣泛使用會(huì)殺死大量對(duì)作物無(wú)害甚至是對(duì)環(huán)境有益的昆蟲(chóng),這些昆蟲(chóng)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能是非常重要的。例如,很多鳥(niǎo)類(lèi)以昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)為食,Bt的廣泛使用會(huì)導(dǎo)致這些地區(qū)鳥(niǎo)的種類(lèi)和分布減少;未降解的Bt制劑流入水域,也會(huì)引起水生動(dòng)物的中毒或致死。

4.1.2對(duì)人和哺乳動(dòng)物的影響一直以來(lái)人們都認(rèn)為Bt在生物防治中對(duì)人和哺乳動(dòng)物沒(méi)有危害,之所以這樣認(rèn)為可能有兩個(gè)原因,一是Bt腸毒素基因與Bc腸毒素基因有差異,使得Bt腸毒素的致病性低于Bc腸毒素;另一原因可能是Bt菌株引起的一些感染特征與Bc引起的感染特征相似而被誤檢為Bc。

隨著對(duì)Bt研究的逐步深入,其活性成分逐漸知曉,特別是其非殺蟲(chóng)活性成分的發(fā)現(xiàn),如溶血素(Hemolysin)、蘇云金素(Thuringiensin)、免疫抑制因子A(InA)、腸毒素(Enterotoxin)等,使人們對(duì)Bt有了新的認(rèn)識(shí),有些Bt菌株對(duì)人和哺乳動(dòng)物也可能存在毒性。近來(lái)有研究表明,Bt與Bc和Ba之間有著很近的親緣關(guān)系,同源程度很高,有試驗(yàn)表明Bt、Bc和Ba的很多基因的同源性在95%以上,在臨床上最常見(jiàn)的危害是導(dǎo)致食物中毒,也可能引起膿腫、腦膜炎、骨髓炎、心膜炎等,從而使科學(xué)家擔(dān)心其大量使用的安全可靠性。已有研究發(fā)現(xiàn),在有些Bt商品中含有類(lèi)似的能引起人畜條件致病的活性成分,如庫(kù)斯塔克亞種和以色列亞種的商業(yè)菌株中含有腸毒素基因并具有溶血活性[13,14]。并且在臨床感染的組織中也分離出了Bt菌株,但是,未被證明是否具有感染能力。還有,殺蟲(chóng)質(zhì)粒和其上的人致病毒素基因在不同菌株之間可以以很低的頻率互相轉(zhuǎn)移,這也增加了Bt對(duì)人畜的潛在危險(xiǎn)性[15,16]。

鑒于以上事實(shí),特別是Bt對(duì)人和哺乳動(dòng)物的毒性,致使有些科學(xué)家提出Bt對(duì)人畜的安全性有待進(jìn)一步提升,因此有必要重新選育一些安全性更可靠、殺蟲(chóng)效率更高的Bt菌株應(yīng)用于生物防治,以避免其對(duì)人的可能毒性。

4.2Bt的遺傳改良

從自然環(huán)境中很難直接分離出不含腸毒素基因,且不產(chǎn)生腸毒素溶血活性同時(shí)又具有高效殺蟲(chóng)質(zhì)粒的Bt菌株。接合轉(zhuǎn)移是一種新的遺傳改良方式,是通過(guò)基因剔除使Bt的病原因子失活或選擇不含腸毒素基因無(wú)溶血活性的Bt或Bc宿主菌,導(dǎo)入高效殺蟲(chóng)質(zhì)粒進(jìn)行遺傳改良,從而篩選出一些既無(wú)致病危害又保留高效殺蟲(chóng)毒力的重組菌株。2003年Yang等[17]把Cry1Ac基因轉(zhuǎn)移到一個(gè)沒(méi)有溶血活性的庫(kù)斯塔克亞種中,結(jié)果獲得的新菌株的殺蟲(chóng)活性與原來(lái)的庫(kù)斯塔克亞種親本菌株的殺蟲(chóng)活性幾乎一樣。

經(jīng)過(guò)多年的研究積累,Bt的遺傳改良工作取得了以下成果。

改良出蠟狀芽孢桿菌DBt248,其不含溶血素hbl基因、非溶血素nhe基因、病原調(diào)控因子plcR和pXO1-ORF101相似片斷,因而沒(méi)有溶血活性,有望作為宿主菌用于蘇云金芽孢桿菌的殺蟲(chóng)蛋白的表達(dá)以構(gòu)建安全高效的殺蟲(chóng)工程菌株[18]。

含有殺蟲(chóng)晶體蛋白基因cry1Ac的高效殺蟲(chóng)質(zhì)粒pHT73能以自然接合轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)移到兩株庫(kù)斯塔克亞種、1株覃狀芽孢桿菌、5株蠟狀芽孢桿菌和1株不含致病因子的達(dá)姆斯特變種中。接合子菌株能表達(dá)相應(yīng)的殺蟲(chóng)晶體蛋白。有試驗(yàn)證明pHT73質(zhì)粒在庫(kù)斯塔克亞種中的轉(zhuǎn)移率較高[18]。

將編碼有多種殺蟲(chóng)毒素基因的大質(zhì)粒pBtoxis接合轉(zhuǎn)移至蠟狀芽孢桿菌群菌株間,發(fā)現(xiàn)pBtoxis的宿主范圍比pHT73窄,轉(zhuǎn)移效率也較低,只有10-8接合子/受體,而且必須在接合輔助質(zhì)粒的幫助下發(fā)生轉(zhuǎn)移。pBtoxis能在芽孢形成期表達(dá)多種毒素蛋白[18]。

將無(wú)腸毒素基因不產(chǎn)生無(wú)腸毒素活性的蠟狀芽孢桿菌導(dǎo)入pBtoxis質(zhì)粒或pHT73質(zhì)粒后,接合子也無(wú)溶血性。研究表明,用無(wú)腸毒素基因不產(chǎn)生無(wú)腸毒素活性的蠟狀芽孢桿菌作為宿主菌,以接合轉(zhuǎn)移的方式構(gòu)建安全的Bt工程菌的設(shè)想是可行的[18]。

plcR基因是一種調(diào)控基因,能調(diào)控溶血素基因、腸毒素基因等基因的活性。用插入失活的方式破壞plcR基因可以使以色列亞種AND672的溶血活性降低。plcR基因的失活不影響殺蟲(chóng)蛋白基因的表達(dá),也不影響其殺蟲(chóng)活性[18]。

以HD-1為初始誘變株經(jīng)紫外線、亞硝基胍、N+離子等注入誘變,篩選出5株對(duì)棉鈴蟲(chóng)有高毒力的誘變株,B47、B28、S159、B209和S218,其毒力分別提升87%、140%、87%、92%和100%,傳代10代后其毒力沒(méi)有明顯下降[19]。

另外,利用基因工程技術(shù),任何生物體都可以獲得并表達(dá)Cry殺蟲(chóng)晶體蛋白,這也是Bt遺傳改良的又一方向。近30年來(lái),隨著轉(zhuǎn)Bt基因作物[20-22](轉(zhuǎn)Bt基因番茄、轉(zhuǎn)Bt基因煙草、轉(zhuǎn)Bt基因棉花、轉(zhuǎn)Bt基因水稻以及轉(zhuǎn)Bt基因玉米等)的不斷問(wèn)世,Bt在生物防治方面的推廣速度和效果使農(nóng)林業(yè)的發(fā)展進(jìn)入了新的產(chǎn)業(yè)化階段。

以上成果說(shuō)明,將現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于Bt菌株的遺傳改良,可以很好地提高其殺蟲(chóng)活性和安全性。

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[8] ARONSON A I, SHAI Y. Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: Unique features of their mode of action[J]. FEMS Microbiol Lett,2001,195(1):1-8.

[9] KRONSTAD J W, SCHNEPF H E, WHITELEY H R. Diversity of locations for Bacillus thuringiensis crystal protein genes[J]. J Bacteriol, 1983,154(1):419-428.

[10] WHITELEY H R, SCHNEPF H E. The molecular biology of parasporal crystal body formation in Bacillus thuringiensis[J]. Annu Rev Microbiol,1986,40:549-576.

[11] 唐韻.我國(guó)生物農(nóng)藥登記品種及其使用技術(shù)[J].農(nóng)藥市場(chǎng)信息,2013(7):39-40.

[12] 喻子牛.蘇云金芽胞桿菌[M].北京:科學(xué)出版社,1990.

[13] HANSEN B M, HENDRIKSEN N B. Detection of enterotoxic Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains by PCR analysis[J]. Appl Environ Microbiol, 2001,67(1):185-189.

[14] 袁志明,蔡全信,ANDRUP L,等.蘇云金芽胞桿菌腸毒素基因的PCR檢測(cè)[J].微生物學(xué)報(bào),2001,41(2):148-154.

[15] VAN DER AUWERA G A,TIMMERY S, MAHILLON J,et al. Plasmid exchanges among members of the Bacillus cereus group in foodstuffs[J]. Int J Food Microbiol,2006,113:164-172.

[16] 黃必旺.蘇云金芽孢桿菌的腸毒素及其安全性研究[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2005.

[17] YANG C Y, PANG J C, KAO S S, et al. Enterotoxigenicity and cytotoxicity of Bacillus thuringiensis strains and development of a process for Cry1Ac production[J]. J Agric Food Chem, 2003,51(1):100-105.

[18] 胡曉敏.蠟狀芽孢桿菌群菌株病原相關(guān)分析及其遺傳改良[D].武漢:中國(guó)科學(xué)院研究生院(武漢病毒研究所),2007.

[19] 劉坤.蘇云金芽孢桿菌高毒菌株菌種選育和制劑研究[D].合肥:合肥工業(yè)大學(xué),2011.

[20] 李桂玲,李明澤,李春奇,等.轉(zhuǎn)Bt基因玉米研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(32):14027-14029.

[21] 王北艷,殷奎德.轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)基因水稻生物安全性探討[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(9):271-273.

[22] 陸宴輝.Bt棉花害蟲(chóng)綜合治理研究前沿[J].應(yīng)用昆蟲(chóng)學(xué)報(bào),2012,49(4):809-819.

4.2Bt的遺傳改良

從自然環(huán)境中很難直接分離出不含腸毒素基因,且不產(chǎn)生腸毒素溶血活性同時(shí)又具有高效殺蟲(chóng)質(zhì)粒的Bt菌株。接合轉(zhuǎn)移是一種新的遺傳改良方式,是通過(guò)基因剔除使Bt的病原因子失活或選擇不含腸毒素基因無(wú)溶血活性的Bt或Bc宿主菌,導(dǎo)入高效殺蟲(chóng)質(zhì)粒進(jìn)行遺傳改良,從而篩選出一些既無(wú)致病危害又保留高效殺蟲(chóng)毒力的重組菌株。2003年Yang等[17]把Cry1Ac基因轉(zhuǎn)移到一個(gè)沒(méi)有溶血活性的庫(kù)斯塔克亞種中,結(jié)果獲得的新菌株的殺蟲(chóng)活性與原來(lái)的庫(kù)斯塔克亞種親本菌株的殺蟲(chóng)活性幾乎一樣。

經(jīng)過(guò)多年的研究積累,Bt的遺傳改良工作取得了以下成果。

改良出蠟狀芽孢桿菌DBt248,其不含溶血素hbl基因、非溶血素nhe基因、病原調(diào)控因子plcR和pXO1-ORF101相似片斷,因而沒(méi)有溶血活性,有望作為宿主菌用于蘇云金芽孢桿菌的殺蟲(chóng)蛋白的表達(dá)以構(gòu)建安全高效的殺蟲(chóng)工程菌株[18]。

含有殺蟲(chóng)晶體蛋白基因cry1Ac的高效殺蟲(chóng)質(zhì)粒pHT73能以自然接合轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)移到兩株庫(kù)斯塔克亞種、1株覃狀芽孢桿菌、5株蠟狀芽孢桿菌和1株不含致病因子的達(dá)姆斯特變種中。接合子菌株能表達(dá)相應(yīng)的殺蟲(chóng)晶體蛋白。有試驗(yàn)證明pHT73質(zhì)粒在庫(kù)斯塔克亞種中的轉(zhuǎn)移率較高[18]。

將編碼有多種殺蟲(chóng)毒素基因的大質(zhì)粒pBtoxis接合轉(zhuǎn)移至蠟狀芽孢桿菌群菌株間,發(fā)現(xiàn)pBtoxis的宿主范圍比pHT73窄,轉(zhuǎn)移效率也較低,只有10-8接合子/受體,而且必須在接合輔助質(zhì)粒的幫助下發(fā)生轉(zhuǎn)移。pBtoxis能在芽孢形成期表達(dá)多種毒素蛋白[18]。

將無(wú)腸毒素基因不產(chǎn)生無(wú)腸毒素活性的蠟狀芽孢桿菌導(dǎo)入pBtoxis質(zhì)?；騪HT73質(zhì)粒后,接合子也無(wú)溶血性。研究表明,用無(wú)腸毒素基因不產(chǎn)生無(wú)腸毒素活性的蠟狀芽孢桿菌作為宿主菌,以接合轉(zhuǎn)移的方式構(gòu)建安全的Bt工程菌的設(shè)想是可行的[18]。

plcR基因是一種調(diào)控基因,能調(diào)控溶血素基因、腸毒素基因等基因的活性。用插入失活的方式破壞plcR基因可以使以色列亞種AND672的溶血活性降低。plcR基因的失活不影響殺蟲(chóng)蛋白基因的表達(dá),也不影響其殺蟲(chóng)活性[18]。

以HD-1為初始誘變株經(jīng)紫外線、亞硝基胍、N+離子等注入誘變,篩選出5株對(duì)棉鈴蟲(chóng)有高毒力的誘變株,B47、B28、S159、B209和S218,其毒力分別提升87%、140%、87%、92%和100%,傳代10代后其毒力沒(méi)有明顯下降[19]。

另外,利用基因工程技術(shù),任何生物體都可以獲得并表達(dá)Cry殺蟲(chóng)晶體蛋白,這也是Bt遺傳改良的又一方向。近30年來(lái),隨著轉(zhuǎn)Bt基因作物[20-22](轉(zhuǎn)Bt基因番茄、轉(zhuǎn)Bt基因煙草、轉(zhuǎn)Bt基因棉花、轉(zhuǎn)Bt基因水稻以及轉(zhuǎn)Bt基因玉米等)的不斷問(wèn)世,Bt在生物防治方面的推廣速度和效果使農(nóng)林業(yè)的發(fā)展進(jìn)入了新的產(chǎn)業(yè)化階段。

以上成果說(shuō)明,將現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于Bt菌株的遺傳改良,可以很好地提高其殺蟲(chóng)活性和安全性。

參考文獻(xiàn):

[1] SCHNEPF E, CRICKMORE N, VAN RIE J. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 1998,62(3):775-806.

[2] 蔡啟良,劉子鐸,喻子牛.蘇云金芽胞桿菌生物活性成分研究進(jìn)展[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2003,9(2):207-212.

[3] 李雪,馬玉超,李煦,等.蘇云金芽胞桿菌伴孢晶體的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(1):5920-5924.

[4] KUMAR P A, SHARMA R P, MALIK V S. The insecticidal protein of Bacillus thuringiensis[J]. Adv Appl Microbiol, 1996,42:l-43.

[5] 李雪雁,李照會(huì),許維岸.蘇云金芽孢桿菌cry基因研究進(jìn)展[J].昆蟲(chóng)知識(shí),2003,40(1):9-13.

[6] MIZUKI E,OHBA M, AKAO T, et al. Unique activity associated with non-insecticidal Bacillus thuringiensis parasporal inclusion:in vitro cell-killing action cancer cells[J]. J Appl Microbiol,1999,86:477-486.

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[18] 胡曉敏.蠟狀芽孢桿菌群菌株病原相關(guān)分析及其遺傳改良[D].武漢:中國(guó)科學(xué)院研究生院(武漢病毒研究所),2007.

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[20] 李桂玲,李明澤,李春奇,等.轉(zhuǎn)Bt基因玉米研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(32):14027-14029.

[21] 王北艷,殷奎德.轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)基因水稻生物安全性探討[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(9):271-273.

[22] 陸宴輝.Bt棉花害蟲(chóng)綜合治理研究前沿[J].應(yīng)用昆蟲(chóng)學(xué)報(bào),2012,49(4):809-819.

4.2Bt的遺傳改良

從自然環(huán)境中很難直接分離出不含腸毒素基因,且不產(chǎn)生腸毒素溶血活性同時(shí)又具有高效殺蟲(chóng)質(zhì)粒的Bt菌株。接合轉(zhuǎn)移是一種新的遺傳改良方式,是通過(guò)基因剔除使Bt的病原因子失活或選擇不含腸毒素基因無(wú)溶血活性的Bt或Bc宿主菌,導(dǎo)入高效殺蟲(chóng)質(zhì)粒進(jìn)行遺傳改良,從而篩選出一些既無(wú)致病危害又保留高效殺蟲(chóng)毒力的重組菌株。2003年Yang等[17]把Cry1Ac基因轉(zhuǎn)移到一個(gè)沒(méi)有溶血活性的庫(kù)斯塔克亞種中,結(jié)果獲得的新菌株的殺蟲(chóng)活性與原來(lái)的庫(kù)斯塔克亞種親本菌株的殺蟲(chóng)活性幾乎一樣。

經(jīng)過(guò)多年的研究積累,Bt的遺傳改良工作取得了以下成果。

改良出蠟狀芽孢桿菌DBt248,其不含溶血素hbl基因、非溶血素nhe基因、病原調(diào)控因子plcR和pXO1-ORF101相似片斷,因而沒(méi)有溶血活性,有望作為宿主菌用于蘇云金芽孢桿菌的殺蟲(chóng)蛋白的表達(dá)以構(gòu)建安全高效的殺蟲(chóng)工程菌株[18]。

含有殺蟲(chóng)晶體蛋白基因cry1Ac的高效殺蟲(chóng)質(zhì)粒pHT73能以自然接合轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)移到兩株庫(kù)斯塔克亞種、1株覃狀芽孢桿菌、5株蠟狀芽孢桿菌和1株不含致病因子的達(dá)姆斯特變種中。接合子菌株能表達(dá)相應(yīng)的殺蟲(chóng)晶體蛋白。有試驗(yàn)證明pHT73質(zhì)粒在庫(kù)斯塔克亞種中的轉(zhuǎn)移率較高[18]。

將編碼有多種殺蟲(chóng)毒素基因的大質(zhì)粒pBtoxis接合轉(zhuǎn)移至蠟狀芽孢桿菌群菌株間,發(fā)現(xiàn)pBtoxis的宿主范圍比pHT73窄,轉(zhuǎn)移效率也較低,只有10-8接合子/受體,而且必須在接合輔助質(zhì)粒的幫助下發(fā)生轉(zhuǎn)移。pBtoxis能在芽孢形成期表達(dá)多種毒素蛋白[18]。

將無(wú)腸毒素基因不產(chǎn)生無(wú)腸毒素活性的蠟狀芽孢桿菌導(dǎo)入pBtoxis質(zhì)粒或pHT73質(zhì)粒后,接合子也無(wú)溶血性。研究表明,用無(wú)腸毒素基因不產(chǎn)生無(wú)腸毒素活性的蠟狀芽孢桿菌作為宿主菌,以接合轉(zhuǎn)移的方式構(gòu)建安全的Bt工程菌的設(shè)想是可行的[18]。

plcR基因是一種調(diào)控基因,能調(diào)控溶血素基因、腸毒素基因等基因的活性。用插入失活的方式破壞plcR基因可以使以色列亞種AND672的溶血活性降低。plcR基因的失活不影響殺蟲(chóng)蛋白基因的表達(dá),也不影響其殺蟲(chóng)活性[18]。

以HD-1為初始誘變株經(jīng)紫外線、亞硝基胍、N+離子等注入誘變,篩選出5株對(duì)棉鈴蟲(chóng)有高毒力的誘變株,B47、B28、S159、B209和S218,其毒力分別提升87%、140%、87%、92%和100%,傳代10代后其毒力沒(méi)有明顯下降[19]。

另外,利用基因工程技術(shù),任何生物體都可以獲得并表達(dá)Cry殺蟲(chóng)晶體蛋白,這也是Bt遺傳改良的又一方向。近30年來(lái),隨著轉(zhuǎn)Bt基因作物[20-22](轉(zhuǎn)Bt基因番茄、轉(zhuǎn)Bt基因煙草、轉(zhuǎn)Bt基因棉花、轉(zhuǎn)Bt基因水稻以及轉(zhuǎn)Bt基因玉米等)的不斷問(wèn)世,Bt在生物防治方面的推廣速度和效果使農(nóng)林業(yè)的發(fā)展進(jìn)入了新的產(chǎn)業(yè)化階段。

以上成果說(shuō)明,將現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于Bt菌株的遺傳改良,可以很好地提高其殺蟲(chóng)活性和安全性。

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[6] MIZUKI E,OHBA M, AKAO T, et al. Unique activity associated with non-insecticidal Bacillus thuringiensis parasporal inclusion:in vitro cell-killing action cancer cells[J]. J Appl Microbiol,1999,86:477-486.

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[16] 黃必旺.蘇云金芽孢桿菌的腸毒素及其安全性研究[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2005.

[17] YANG C Y, PANG J C, KAO S S, et al. Enterotoxigenicity and cytotoxicity of Bacillus thuringiensis strains and development of a process for Cry1Ac production[J]. J Agric Food Chem, 2003,51(1):100-105.

[18] 胡曉敏.蠟狀芽孢桿菌群菌株病原相關(guān)分析及其遺傳改良[D].武漢:中國(guó)科學(xué)院研究生院(武漢病毒研究所),2007.

[19] 劉坤.蘇云金芽孢桿菌高毒菌株菌種選育和制劑研究[D].合肥:合肥工業(yè)大學(xué),2011.

[20] 李桂玲,李明澤,李春奇,等.轉(zhuǎn)Bt基因玉米研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(32):14027-14029.

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[22] 陸宴輝.Bt棉花害蟲(chóng)綜合治理研究前沿[J].應(yīng)用昆蟲(chóng)學(xué)報(bào),2012,49(4):809-819.