吳金霞 桑苗苗 曹文嘉 鄭駿年 裴冬生

Ras超家族在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著分子開關(guān)的作用,可作用于下游的多種受體蛋白,介導(dǎo)細胞外信號引起的胞質(zhì)或胞核生物學(xué)特性的改變,調(diào)控細胞的多種生命活動進程[1,2].Rap蛋白(Rap1a, Rap1b, Rap2a, Rap2b,Rap2c)屬Ras相關(guān)小GTP酶蛋白超家族.Rap1與Ras擁有相同的效應(yīng)因子結(jié)構(gòu)域,提示Rap1可與Ras競爭其下游效應(yīng)因子,從而發(fā)揮拮抗Ras的功能.Rap2有其獨特的生物學(xué)特性,其亞細胞定位主要集中在胞膜及內(nèi)膜系統(tǒng),在細胞靜息狀態(tài)下的活化水平超過50%,并且其效應(yīng)因子結(jié)構(gòu)域的第39位氨基酸殘基為苯丙氨酸.因此,Rap2與Rap1和Ras在效應(yīng)因子結(jié)構(gòu)域的微小差異使得Rap2可能擁有特異的效應(yīng)因子從而產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng).

Rap2a最先于1988年由Pizon等[3]在對BurKitt's淋巴瘤cDNA文庫進行篩選時被發(fā)現(xiàn),主要定位于細胞膜和內(nèi)膜系統(tǒng).Rap2a基因全長549 bp,編碼183個氨基酸,定位于13q34,其結(jié)構(gòu)域組成與Ras家族蛋白相似,主要包括第32-40位氨基酸位置上的效應(yīng)因子結(jié)構(gòu)域,第11-148位氨基酸殘基的5個散在分布的核苷酸結(jié)合域和C末端的CAAX基序.其C端CAAX基序與膜定位功能有關(guān),此基序突變后可引起Rap2a許多功能喪失[4,5].值得一提的是,Rap在調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白的功能和細胞粘附,進而控制細胞運動和細胞與基質(zhì)的相互聯(lián)系方面起著重要的作用[6,7].除了細胞這些生物學(xué)方面的基礎(chǔ)性研究外,近些年來人們把目光又集中到Rap的一些特殊功能以及腫瘤方面的研究.腫瘤細胞的遷移和粘附在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用,有報道[8,9]顯示Rap2蛋白可影響人類多種腫瘤的遷移和粘附從而影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移.但其對肺癌的發(fā)生發(fā)展有何意義,目前尚未見報道.

1 材料和方法

1.1 材料 骨肉瘤細胞株U2OS,肺癌細胞株H1299和A549,人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC),DH5α感受態(tài)細胞及pcDNA3.1(+)為本實驗室保存.限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI,RT-PCR試劑盒及T4 DNA連接酶購自Takara公司;PCR試劑盒購自天根生化科技有限公司;質(zhì)粒DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自Promega公司;RNA抽提試劑盒、質(zhì)粒中量提取試劑盒購自Qiagen公司;質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000為美國Invitrogen公司產(chǎn)品.兔抗人Rap2a抗體購自Abcam公司,抗人β-actin一抗購自美國Santa Cruz公司.熒光羊抗鼠和熒光羊抗兔IgG購自美國Licor公司,經(jīng)Odyssey掃描儀掃描處理.

1.2 方法

1.2.1 Western blot檢測Rap2a在肺癌細胞中的表達 使用冰浴的細胞裂解buffer從各組細胞中提取細胞總蛋白.蛋白樣品用12.5% SDS-PAGE跑膠后轉(zhuǎn)膜至NC膜上.脫脂牛奶室溫封閉1 h后用抗Rap2a抗體過夜.充分洗膜后室溫孵育二抗1 h,再次洗膜后顯影.

1.2.2 cDNA的獲取 人骨肉瘤細胞株U2OS棄去細胞表面培養(yǎng)基,胰酶消化細胞并用PBS沖洗后,按照Qiagen公司RNA抽提試劑盒說明書進行.抽提的RNA根據(jù)所測得的濃度取出相應(yīng)含量的RNA用于反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA文庫.1.2.3 基因克隆 參照Genebank refseq中收錄的NM_021033.6序列,設(shè)計針對Rap2a基因全長開放閱讀框(open reading frame, ORF)區(qū)引物,上游5'GAAGCTTAT GCGCGAGTACAAAG3',下游5'GGAAttCCTAttGTATGttACATG3',以已獲得的cDNA文庫為模版,PCR擴增得到特異性產(chǎn)物.

1.2.4 pcDNA3.1(+)-Rap2a質(zhì)粒的構(gòu)建 擴增的Rap2a基因,經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切后,用T4 DNA連接酶連接到同樣用EcoRI和HindIII雙酶切的pcDNA3.1(+)中,構(gòu)建pcDNA3.1(+)-Rap2a真核表達質(zhì)粒.經(jīng)酶切初步鑒定后送上海華大基因科技有限公司測序驗證.

1.2.5 細胞轉(zhuǎn)染 待細胞處于約80%-90%融合時進行轉(zhuǎn)染.按小皿的標(biāo)準(zhǔn)計算,每孔加入2 μg質(zhì)粒,用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染.

1.2.6 Transwell小室遷移實驗 H1299和A549細胞轉(zhuǎn)染Rap2a 24 h后,用胰酶消化收集細胞,用無血清培養(yǎng)基制成濃度為3 X104/mL的細胞懸液150 μL,加入Transwell小室的上室,下室加入600 μL含有10% FBS的條件培養(yǎng)基,繼續(xù)在孵育箱中培養(yǎng)12 h.12 h后,室溫固定,結(jié)晶紫染色,用濕棉簽小心擦去上室底部膜表面上的細胞后顯微鏡下隨機取5個視野拍照,計數(shù)并統(tǒng)計結(jié)果.

1.2.7 明膠酶譜實驗 細胞轉(zhuǎn)染同前,轉(zhuǎn)染后48 h換成1 mL無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h.次日收集上清液,將上清液移入離心管,2,000 rpm離心10 min,BCA法測定各樣品蛋白濃度,根據(jù)不同濃度確定樣品的上樣體積,保證各樣品上樣的蛋白質(zhì)量相同,與4X上樣緩沖液混合,跑膠,分別置于孵育液、洗脫液、脫色液中處理,顯出基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)2位于藍色背景上的透亮帶,用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析讀取條帶面積,寬度和灰度值,做統(tǒng)計分析.

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗分析.P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 Rap2a蛋白在肺癌細胞中的表達水平 以HUVEC作為對照,采用Western blot技術(shù)檢測Rap2a蛋白在H1299和A549兩種肺癌細胞中的內(nèi)源性表達量.結(jié)果顯示相對于正常細胞組,肺癌細胞中Rap2a表達明顯增高(圖1).

圖 1 Rap2a蛋白在肺癌細胞H1299和A549中的表達.A:Western blot檢測Rap2a蛋白在各組中的表達;B:Rap2a蛋白灰度分析.與HUVEC組比較:**P<0.01(n=3).Fig 1 Rap2a protein expression in H1299 and A549 cell lines. A: Western blot was used to analyze the expression of Rap2a protein; B: Densitometric analysis of Rap2a. The intensity of Rap2a was quantified by densitometry (software: Image J, NIH). Compared with HUVEC group: **P<0.01 (n=3).

2.2 Rap2a真核表達質(zhì)粒構(gòu)建 以骨肉瘤細胞株U2OS抽提并反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,用設(shè)計的Rap2a引物PCR,結(jié)果顯示經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳的PCR產(chǎn)物在500 bp-600 bp之間,與Rap2a基因的549 bp位置大概一致(圖2).成功將Rap2a基因的全長ORF區(qū)克隆至pcDNA3.1(+)真核表達載體,用EcoRI和HindIII雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證并送專業(yè)公司測序,核酸測序結(jié)果與Genebank序列完全一致(圖3).

圖 2 PCR鑒定Rap2a電泳圖.M:1,500 bp DNA Marker;S:Rap2a.Fig 2 Rap2a of PCR amplification products. M: 1,500 bp DNA Marker; S: Rap2a.

2.3 pcDNA3.1(+)-Rap2a在真核細胞中表達的鑒定 為進一步檢測Rap2a蛋白是否表達成功,我們用pcDNA3.1(+)-Rap2a轉(zhuǎn)染H1299和A549細胞,提取總蛋白,用抗Rap2a抗體檢測Rap2a在H1299及A549細胞的表達,以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒組作為對照.結(jié)果顯示相對于空白載體組,過表達組Rap2a表達明顯增加(圖4).

2.4 Rap2a對腫瘤細胞遷移能力的影響 我們對兩種肺癌細胞進行了Transwell細胞遷移實驗.用pcDNA3.1(+)-Rap2a轉(zhuǎn)染H1299和A549細胞,以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒組作為對照.結(jié)果顯示實驗組細胞的遷移率明顯高于空白載體組,說明Rap2a過表達可促進肺癌細胞H1299和A549的遷移(圖5).

圖 3 pcDNA3.1(+)-Rap2a克隆構(gòu)建.A:由左至右依次為M1:1,500 bp DNA Marker;1:pcDNA3.1(+);2:pcDNA3.1(+)-Rap2a;3:pcDNA3.1(+)-Rap2a;M2:10,000 bp DNA Marker;B:Rap2a測序結(jié)果峰圖.Fig 3 Vector construct of pcDNA3.1(+)-Rap2a. A is electrophoretogram of pcDNA3.1(+)-Rap2a, from left to right: DNA Marker, pcDNA3.1,pcDNA3.1(+)-Rap2a, pcDNA3.1(+)-Rap2a, DNA Marker; B is sequencing result of Rap2a.

圖 4 轉(zhuǎn)染Rap2a質(zhì)粒后Western blot檢測Rap2a蛋白的表達.A:Western blot檢測Rap2a過表達效果;B:Rap2a蛋白灰度分析.與vector組比較:**P<0.01(n=3).Fig 4 Western blot analyses of Rap2a after transfection with the Rap2a expressing vector. A: Western blot was used to analyze the expression of Rap2a protein after transfection with Rap2a; B: Densitometric analysis of Rap2a. The intensity of Rap2a was quantified by densitometry (software:Image J, NIH). Compared with vector group: **P<0.01 (n=3).

2.5 Rap2a過表達后對細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2的影響 明膠酶譜實驗檢測了H1299和A549兩種肺癌細胞分泌MMP2活性的表達.結(jié)果顯示,Rap2a過表達后兩種肺癌細胞分泌MMP2的量明顯增加.灰度分析其MMP2表達量也明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).說明上調(diào)Rap2a的同時也能上調(diào)MMP2的表達(圖6).

3 討論

圖 5 Rap2a過表達后對肺癌細胞H1299和A549遷移能力的影響(X100).A:Transwell檢測細胞遷移能力.B:細胞穿膜細胞數(shù)統(tǒng)計圖.與vector組比較:**P<0.01 (n=3).Fig 5 The impact of Rap2a overexpression on lung cancer cell migration (X100). A: Transwell were applied to test the impact of Rap2a expression on the cell migration of H1299 and A549 after transfection; B: Statistical figure of the numbers of cell permeating septum. Compared with vector group: **P<0.01 (n=3).

圖 6 Rap2a過表達后明膠酶譜檢測細胞分泌MMP2的情況.A:明膠酶譜檢測細胞分泌MMP2情況;B:MMP2灰度分析.與vector組比較:**P<0.01 (n=3).Fig 6 Gelatin zymography analysis of the relative enzyme activities of cleaved-MMP2 after overexpression of Rap2a. A:Gelatin zymography was used to analyze the expression of MMP2 after transfection with Rap2a; B: Densitometric analysis of MMP2. The intensity of MMP2 was quantified by densitometry(software: Image J, NIH). Compared with vector group: **P<0.01(n=3). MMP: matrix metalloproteinase.

腫瘤的發(fā)生來自于體細胞突變后產(chǎn)生致癌基因或抑制了腫瘤抑制基因,它是一個多步驟的過程.腫瘤細胞的兩大特點是失控性的增殖和侵襲[10].Rap蛋白是一個小分子量GTP結(jié)合蛋白家族,與Ras原癌基因具大多數(shù)序列同源性[11].自從Rap家族被發(fā)現(xiàn),人們將大多的注意力集中在Rap1蛋白.有研究結(jié)果顯示Rap1的異常活化能促進腫瘤細胞的增殖和侵襲[12,13],且Rap1GAP能抑制細胞骨架的重構(gòu)和甲狀腺癌細胞的運動[14].最近有報道[7]顯示Rap2蛋白與Rap1類似,也能調(diào)節(jié)細胞的粘附.Rap1GAP和Rap2共表達在正常的甲狀腺濾泡細胞.在正常的甲狀腺細胞中無Rap1表達,但是Rap1卻出現(xiàn)在乳頭狀甲狀腺癌中,而且甲狀腺癌中也發(fā)現(xiàn)了Rap2的高表達.這表明Rap活性的增強與腫瘤發(fā)生緊密相關(guān).兩種Rap蛋白的出現(xiàn)提示當(dāng)Rap1GAP下調(diào)后Rap1和Rap2都被活化.當(dāng)?shù)退絉ap1GAP瞬時表達,其能力可充分阻斷乳頭狀或未分化甲狀腺癌細胞株的內(nèi)源性Rap2活性時,Rap1GAP可以減弱細胞遷移侵襲的能力[15].Dominissini等[16]也發(fā)現(xiàn)Rap2a和AMFR通過下調(diào)microRNA成為膠質(zhì)瘤遷移和侵襲的主要調(diào)節(jié)者.Prabakaran等[17]發(fā)現(xiàn)從濾泡甲狀腺癌分離的侵襲性細胞Rap2a高表達.而且,有報道[18]顯示Rap2與腫瘤的形成及惡性轉(zhuǎn)變也有關(guān),Rap2下游效應(yīng)因子RPIP9在乳腺癌中活性升高,而且其活性與乳腺癌的惡性轉(zhuǎn)移程度密切相關(guān).而Rap2另一下游效應(yīng)因子MAP4K4在多種腫瘤組織中高表達,其活性程度與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)[19].但是,Bigler等[20]卻發(fā)現(xiàn)前列腺癌細胞中活化的Rap2a下降.綜上所述,Rap2a對腫瘤細胞的遷移能力是促進還是抑制作用目前還存在一定爭議,且其對肺癌細胞遷移能力的影響未見報道.

本實驗克隆得到了Rap2a基因的全長ORF區(qū)的真核表達質(zhì)粒,通過轉(zhuǎn)染H1299和A549兩種肺癌細胞發(fā)現(xiàn)Rap2a蛋白成功表達于肺癌細胞.通過Transwell小室遷移實驗發(fā)現(xiàn),Rap2a過表達后能引起肺癌細胞遷移能力增強,且作用效果明顯.MMP2是一種基質(zhì)金屬蛋白酶,屬MMPs家族,幾乎能降解細胞外基質(zhì)中各種蛋白,在腫瘤侵潤中發(fā)揮重要作用.明膠酶譜實驗結(jié)果顯示Rap2a過表達使細胞分泌MMP2的量隨之增加.這些結(jié)果提示Rap2a很可能成為新的候選癌基因.本研究將為后續(xù)研究Rap2a對腫瘤細胞的其它功能打下基礎(chǔ),在后期研究中我們將致力于擴展Rap2a基因在肺癌細胞中的功能和機制研究及體外成瘤實驗,為肺癌的早期診斷和治療提供一定理論依據(jù).