陳廣理，龔樹(shù)生，陳 沛，羅凌惠

鼻咽癌中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的實(shí)驗(yàn)研究

陳廣理1，龔樹(shù)生2，陳 沛3，羅凌惠3

目的研究堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在鼻咽癌中的表達(dá)，探討它與鼻咽癌的增生、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法在26例鼻咽癌及相應(yīng)癌旁組織和10例正常鼻咽部黏膜組織中，應(yīng)用RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在鼻咽癌組織中高表達(dá)，在正常鼻咽部黏膜中低表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子與鼻咽癌的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。

鼻咽癌；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；RT-PCR；免疫組織化學(xué)

腫瘤的增生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管為它提供的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而在腫瘤血管生成過(guò)程中起重要誘導(dǎo)作用的物質(zhì)是血管生長(zhǎng)因子，它促進(jìn)腫瘤新生血管的生成[1]。多種誘導(dǎo)血管生成的生長(zhǎng)因子已被闡明，其中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)在腫瘤新生血管生成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[2]。研究表明，bFGF在多種腫瘤高表達(dá)，與腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在腫瘤中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與分化，誘導(dǎo)腫瘤新生血管的形成。臨床上鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是具有極高浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力的腫瘤，為了了解bFGF在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法研究bFGF在鼻咽癌中的表達(dá)，探討其與鼻咽癌的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料鼻咽癌及相應(yīng)癌旁組織26例，來(lái)源于我院鼻咽部活檢及手術(shù)切除的標(biāo)本，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例19例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例7例。癌旁組織取自腫瘤邊緣5 mm以外區(qū)域，為肉眼下癌旁組織；正常鼻咽部黏膜組織10例，來(lái)源于鼻咽部正常的手術(shù)病人。全部腫瘤組織經(jīng)病理診斷均為鱗狀細(xì)胞癌，其中高分化3例、中分化4例、低分化19例。根據(jù)腫瘤的生長(zhǎng)范圍和擴(kuò)散的程度，按國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)(1997)和美國(guó)癌癥分期聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)(2002)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：I期6例(T1N0M0)、II期14例(其中II期A：T2aN0M01例；II期B：T1N1M09例、T2aN1M02例、T2bN0N1M02例)、III期3例(其中T1N2M02例、T2aT2bN1M01例)、IV期3例(其中IV期A：T4N1N2M01例；IV期B：T3N3M01例；IV期C：T4N3M11 例 )。所有腫瘤患者中，男19例，女7例，年齡27～78歲，平均(48.03±5.52)歲，術(shù)前均未經(jīng)化療或放療。

1.2 主要試劑和儀器逆轉(zhuǎn)錄酶MLV(MBI)，TRIzol試劑(GibCO),dNTP(MBI)，TaqDNA聚合酶(MBI)，bFGF單克隆抗體(美國(guó)SIGMA)，二抗體(美國(guó)ZYMED)，GDS8000型凝膠成像系統(tǒng)(UVP)，PTC-200 PCR儀(MJA)，Grab-it 4.0分析軟件為Gelworks 1D interdiate，DU650型紫外光分光光度儀(BECKMAN)。

1.3 引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 引物序列表

1.4 組織RNA提取和cDNA合成取約50 mg組織放入勻漿器中，加入1 mL TRIzol勻漿，用氯仿和異丙醇逐步提取RNA，溶于焦碳酸二乙脂水中，然后應(yīng)用紫外分光光度儀檢測(cè)定量。

1.5 RT-PCR反應(yīng)以cDNA為模板，擴(kuò)增β-actin (300 bp)、bFGF (223 bp)等基因片斷。目的基因bFGF和內(nèi)參基因β-actin引物在同一EP管中進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為25 μL，含上述基因cDNA 2.0 μL，上游和下游引物的終濃度各0.2 μmol/L，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 的終濃度0.2 mmol/L，TaqDNA聚合酶1 U，Mg2+的終濃度2.0 mmol/L。RT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 1 min、50℃ 1 min、72℃ 1 min，72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物電泳,用grab-It成像系統(tǒng)照像，然后用分析各條帶的積分吸光密度值，以目的基因與β-actin的相對(duì)積分吸光密度值記錄結(jié)果。

1.6 免疫組織化學(xué)染色采用SP法作bFGF免疫組織化學(xué)染色。 抗bFGF單克隆抗體1∶100稀釋，DAB顯色液顯色，呈棕黃色著色，以正常小鼠血清代替一抗體為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察：bFGF陽(yáng)性細(xì)胞染色定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和部分細(xì)胞核，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色著色，每張玻片分別在雙目顯微鏡下放大200倍，隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行圖像分析，分析各張玻片的bFGF的平均吸光密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，方法是應(yīng)用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，分析bFGF mRNA及蛋白質(zhì)在鼻咽癌與鼻咽部正常黏膜表達(dá)的差異，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在鼻咽癌組織中bFGFmRNA高表達(dá)，在正常鼻咽部黏膜中低表達(dá)本實(shí)驗(yàn)研究表明bFGF mRNA在全部鼻咽癌組織中高表達(dá)(圖1)，bFGFmRNA在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織中平均相對(duì)吸光度值分別為：0.862±0.039和0.870±0.039，它們二者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 1.394，P>0.05)。bFGF mRNA在鼻咽癌癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中低表達(dá)(圖1)，相對(duì)平均吸光度值分別為：0.211±0.033、0.209±0.037。二值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 1.361，P>0.05)。bFGF mRNA在鼻咽癌組織中的表達(dá)與在正常鼻咽部黏膜的表達(dá)之間，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

M：DL1200 Marker；1～4：無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織、癌旁組織、正常鼻咽部黏膜中的PCR產(chǎn)物(223 bp)。

圖1bFGFmRNA在鼻咽癌、癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中的表達(dá)

2.2 bFGF蛋白質(zhì)在鼻咽癌組織中高表達(dá)，在正常鼻咽部黏膜中低表達(dá)bFGF在鼻咽癌組織中高表達(dá)，定位于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(圖2)，平均吸光度值為：0.325±0.016；在正常鼻咽部黏膜弱表達(dá)或不表達(dá)(圖3)，細(xì)胞的平均吸光度值為：0.071±0.011。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=40.173，P<0.01)。

圖2 鼻咽癌中bFGF表達(dá)(bFGF免疫組化SP×400)

圖3 正常鼻咽部黏膜上皮bFGF表達(dá)(bFGF免疫組化SP×400)

3 討論

鼻咽癌為我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，多見(jiàn)于我國(guó)南方的廣東、廣西、湖南、福建、江西等省份，男性發(fā)病率為女性的2～3倍，40～50歲為高發(fā)年齡段。鼻咽癌是極易轉(zhuǎn)移的腫瘤，通常頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移常為患者最早發(fā)現(xiàn)的體征，頸部腫塊為此病首發(fā)癥狀者約占60%。bFGF是廣泛存在于體內(nèi)多種組織的一類多肽生長(zhǎng)因子，對(duì)機(jī)體細(xì)胞有明顯的促增殖作用，在機(jī)體的血管形成、創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，多種腫瘤細(xì)胞中bFGF高表達(dá)，其與腫瘤的分化、浸潤(rùn)、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和腫瘤新血管的生成有密切關(guān)系[3]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明，bFGF在鼻咽癌組織中均高表達(dá)，在癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中低表達(dá)，它們?cè)诒茄拾└髌诮M織與在正常喉黏膜的表達(dá)之間，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鼻咽癌的快速生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移與bFGF的高表達(dá)有密切的關(guān)系。主要發(fā)生機(jī)制討論如下。

腫瘤血管生成是腫瘤生長(zhǎng)的前提,其與多種生長(zhǎng)因子的刺激有關(guān),其中bFGF是內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用效果最強(qiáng)的因子之一[4]。主要機(jī)制是bFGF調(diào)節(jié)細(xì)胞外分子，包括膠原酶、蛋白激酶、整合素等的活性，促進(jìn)毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞的分化及毛細(xì)管內(nèi)腔的形成。在腫瘤中新生血管形成以及蛋白激酶和整合素等分子的調(diào)節(jié)作用，利于腫瘤細(xì)胞增殖和向細(xì)胞外基質(zhì)侵襲，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。多種文獻(xiàn)報(bào)道，bFGF及其高親和力受體FGFR在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如肝癌、食管癌、肺癌等，促進(jìn)這些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，bFGF與FGFR結(jié)合進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的新生血管形成，加速腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[5]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，bFGF在鼻咽癌組織中高表達(dá)，在癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中低表達(dá)，表明bFGF促進(jìn)了鼻咽癌的新生血管生成。

研究表明，bFGF具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和刺激血管生長(zhǎng)的作用。在腫瘤組織中bFGF高表達(dá)及基因活性增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤血管新生，增加腫瘤組織的血液供應(yīng)，從而為腫瘤細(xì)胞快速增殖提供氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和增殖[6]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，bFGF在鼻咽癌組織中均高表達(dá)，表明bFGF促進(jìn)了鼻咽癌細(xì)胞的增殖。

侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最本質(zhì)的特征，與腫瘤新生血管密切相關(guān)，血管形成是腫瘤侵襲的一個(gè)重要條件。腫瘤組織一旦有新生血管長(zhǎng)入，則腫瘤會(huì)呈指數(shù)生長(zhǎng)并獲得轉(zhuǎn)移能力，此時(shí)稱為腫瘤生長(zhǎng)的血管期。血管形成本身就有一定的侵蝕性，腫瘤細(xì)胞可以沿著新生血管所開(kāi)啟的膠原裂隙侵蝕。另外腫瘤新生血管僅排列一層內(nèi)皮細(xì)胞，缺乏平滑肌，基膜變薄或缺如，使得新生血管容易被腫瘤細(xì)胞穿透，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。bFGF促進(jìn)腫瘤新生血管形成的作用，有利于腫瘤細(xì)胞向細(xì)胞外基質(zhì)侵襲，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[7]。

[1]Smolle E,Taucher V,Petru E,et al.Targeted treatment of ovarian cancer—the multiple-kinase-inhibitor sorafenib as a potential option[J].Anticancer Res,2014,34(4):1519-1530.

[2]Karaman S,Detmar M.Mechanisms of lymphatic metastasis[J].J Clin Invest,2014,124(3):922-928.

[3]Nomura T,Morishita A,Jian G,et al.Expression of angiogenic factors in hepatocarcinogenesis：identification by antibody arrays[J].Oncol Rep.2013,30(5): 2476-2480.

[4]Attoub S,Arafat K,Gélaude A,et al.Frondoside a suppressive effects on lung cancer survival,tumor growth,angiogenesis,invasion,and metastasis[J].PLoS One,2013,8(1):e53087.

[5]Korampalli TS,Stafford ND.Expression of angiogenic growth factors in laryngeal carcinoma[J].Mol Clin Oncol.2013,1(6):1013-1018.

[6]Li W,Wang C,Juhn SK,et al.Expression of fibroblast growth factor binding protein in head and neck cancer[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg.2009,135 (9):896-901.

[7]Haley EM,Kim Y.The role of basic fibroblast growth factor in glioblastoma multiforme and glioblastoma stem cells and in their in vitro culture[J].Cancer Lett,2014,346(1):1-5.

ExpressionofBasicFibroblastGrowthFactorinNasopharyngealCarcinomaandItsSignificance

CHEN Guang-li,GONG Shu-sheng,CHEN Pei,et al

(Third Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo study the expressions of basic fibroblast growth factor(bFGF) in nasopharyngeal carcinoma(NPC) and its significance.MethodsIn this study,we investigated the expression level of bFGF in twenty-six NPC and tissues adjacent to tumor and ten normal nasopharyngeal mucous membrane using techniques of semi-quantify RT-PCR and immunohistochemistry.ResultsIt was showed that the expression level of bFGF was significantly increased in NPC as compared with the normal nasopharyngeal mucous membrane (P<0.01).ConclusionThese data raise the possibility that bFGF may play key roles in the growth,invasion and metastasis of NPC.

nasopharyngeal carcinoma; bFGF; RT-PCR

2014-03-18

1.河南科技大學(xué)第三附屬醫(yī)院洛陽(yáng)東方醫(yī)院耳鼻咽喉科，河南洛陽(yáng) 471003 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100730 3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院耳鼻咽喉科，湖北武漢 430022

陳廣理(1971-)，男，河南鄢陵人，副主任醫(yī)師，從事耳鼻咽喉科基礎(chǔ)與臨床工作。

R739.63

A

1672-688X(2014)02-0094-03