高 雙 倪倩雯 周 敏 徐雷鳴#

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)鏡診治部1(200092) 上海市小兒消化與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2

光動(dòng)力療法(photodynamic therapy, PDT)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種新型抗腫瘤治療手段，已成為腫瘤防治領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前，關(guān)于PDT在體內(nèi)靶向治療胰腺癌的研究甚少。RGD(Arg-Gly-Asp)肽廣泛存在于生物體內(nèi)，通過其RGD序列特異性結(jié)合細(xì)胞表面的αvβ3整合素受體，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞間的黏附作用[1-2]。αvβ3整合素在成熟的內(nèi)皮細(xì)胞表面低表達(dá)，在多種腫瘤細(xì)胞和活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面高表達(dá)[3]。本研究以量子點(diǎn)-RGD(quantum dots-RGD, QDs-RGD)探針作為光敏劑，探討PDT聯(lián)合吉西他濱對(duì)胰腺癌移植瘤祼鼠的治療效應(yīng)，以期為胰腺癌的治療提供新途徑。

材料與方法

一、細(xì)胞株、主要試劑和儀器

人胰腺癌細(xì)胞株SW1990購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，由新華醫(yī)院科研中心凍存。5～6周齡SPF級(jí)BALB/c裸鼠42只，雌雄各半，體質(zhì)量17～22 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。QDs由上海大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院提供(QDs發(fā)射光譜為630 nm)；RGD購自吉爾生化(上海)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)購自美國Xenogen公司；吉西他濱購自美國Lilly公司；半導(dǎo)體激光器(630 nm, 100 mW)購自德國DILAS公司。

二、方法

1. QDs-RGD探針合成：氨基水溶性QDs經(jīng)偶聯(lián)劑sulfo-SMCC活化后，過脫鹽柱提純，與RGD偶聯(lián)反應(yīng)生成QDs-RGD，過脫鹽柱提純，終產(chǎn)物保存于50 mmol/L 硼酸鹽(pH 8.4，含0.05% NaN3)緩沖液中。

2. 胰腺癌移植瘤模型制備：人胰腺癌細(xì)胞株SW1990接種于RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化，隔2～3 d 傳代。收集對(duì)數(shù)生長期SW1990細(xì)胞，重懸于PBS液中，將0.2 mL細(xì)胞懸液(約含105個(gè)細(xì)胞)接種于裸鼠右側(cè)臀背部皮下。接種2周后以游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤結(jié)節(jié)的長徑(a)、短徑(b)、高度(c)，計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積(V)=π/6×a×b×c。腫瘤體積達(dá)0.4～0.6 cm3判斷為造模成功。

3. 小動(dòng)物活體成像術(shù)：隨機(jī)取2只造模成功的裸鼠，分別經(jīng)尾靜脈注射0.3 nmoL QDs-RGD和QDs探針，采用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀察不同時(shí)點(diǎn)(1、5、10、24 h)QDs-RGD、QDs在裸鼠體內(nèi)的分布情況。

4. 模型分組：取40只造模成功的裸鼠，隨機(jī)分為5組，每組8只：對(duì)照組(不給予任何治療)；單純光照組(激光630 nm，120 J/cm2，持續(xù)照射20 min)；PDT組(QDs-RGD 0.5 nmol+激光照射)；吉西他濱組(吉西他濱50 mg/kg)；聯(lián)合治療組(QDs-RGD 0.5 nmol+激光照射+吉西他濱50 mg/kg)。PDT組和聯(lián)合治療組在激光照射前5 h腹腔注射QDs-RGD 0.5 nmol。聯(lián)合治療組在激光照射前1 h和照射后第3、6、9 d腹腔注射吉西他濱，共4次；吉西他濱組的吉西他濱注射劑量、時(shí)間與聯(lián)合治療組相同。第18 d處死全部裸鼠，取出瘤體，稱重并測(cè)量體積，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=[1-(治療組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)]×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、QDs-RGD探針表達(dá)情況

小動(dòng)物活體成像示，QDs-RGD注射1 h后，隨著時(shí)間的延長，腫瘤顯影逐漸清晰，顯影范圍逐漸擴(kuò)大，并接近瘤體實(shí)際大小，注射5 h后顯影達(dá)高峰，隨后逐漸減弱。QDs注射后5 h內(nèi)可見一過性顯影，且瘤體附近的聚集濃度明顯低于QDs-RGD，注射10 h后腫瘤部位已無顯影(圖1)。

圖1 不同時(shí)點(diǎn)QDs-RGD、QDs探針在荷瘤祼鼠體內(nèi)的聚集情況

二、各組瘤重、瘤體積和抑瘤率

PDT組、吉西他濱組和聯(lián)合治療組的瘤重、瘤體積均顯著低于對(duì)照組和單純光照組(P<0.01)，其中聯(lián)合治療組又顯著低于PDT組和吉西他濱組(P<0.05)；對(duì)照組與單純光照組間、PDT組與吉西他濱組間瘤重、瘤體積差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。聯(lián)合治療組、吉西他濱組、PDT組的抑瘤率分別為70.5%、43.5%、37.1%(表1)。

表1 各組瘤重、瘤體積和抑瘤率比較

討 論

胰腺癌是一種死亡率較高的惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿，進(jìn)展迅速，大多數(shù)患者明確診斷時(shí)已處于晚期，手術(shù)切除率僅10%～15%，根治術(shù)后行輔助治療患者的存活期僅11～23個(gè)月，5年生存率僅約20%[4-6]。因此，探討安全、有效的治療手段成為胰腺癌研究的重點(diǎn)課題。

PDT是一種發(fā)展迅速的新型抗腫瘤方法，具有選擇性好、毒性小、起效快、可重復(fù)以及與其他傳統(tǒng)療法有協(xié)同作用等優(yōu)點(diǎn)。PDT的主要原理是使光敏劑選擇性聚集于腫瘤組織內(nèi)，在特定波長的光照下通過光化學(xué)或生物學(xué)反應(yīng)對(duì)腫瘤組織產(chǎn)生殺傷效應(yīng)[7]。然而，光敏劑在組織、器官中的非特異性攝取和分布使PDT的應(yīng)用具有一定局限性。因此，光敏劑的選擇是PDT治療效應(yīng)的決定性因素。

近年來，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，QDs在腫瘤研究中的應(yīng)用越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。 QDs是由Ⅱ-Ⅳ族元素(如Cdse、Cds)或Ⅲ-Ⅴ族元素(如InP、InAs)組成的直徑<100 nm的半導(dǎo)體納米微晶體。用于熒光標(biāo)記的QDs直徑一般<10 nm，激發(fā)可發(fā)射熒光[8]。與傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料相比，QDs作為生物熒光探針具有生物相容性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、熒光強(qiáng)度高、顏色可控、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄等優(yōu)點(diǎn)?；赒Ds的諸多特定光學(xué)特性可滿足光敏劑所需的條件，本研究采用QDs作為光敏劑探討PDT對(duì)胰腺癌的治療效應(yīng)。

目前，QDs探針技術(shù)已能有效檢測(cè)腫瘤血管發(fā)生和腫瘤生長情況，在腫瘤定位、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的定位以及個(gè)體化治療中起重要作用。為進(jìn)一步增加QDs在體內(nèi)定位的特異性，將特異性靶向肽段與QDs整合的技術(shù)已逐漸得到應(yīng)用。Akerman等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，將肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤血管、腫瘤淋巴管的特異性靶向肽段包被于QDs，注射入小鼠移植瘤模型，可精確地靶向結(jié)合于相應(yīng)組織器官。Cai等[3,10]的研究顯示，QDs與靶向αvβ3整合素的肽段RGD偶聯(lián)后，能有效地將QDs靶向運(yùn)輸至腫瘤組織內(nèi)。基于上述理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，本研究組在前期研究[11]中已成功將QDs與RGD偶聯(lián)，并在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)QDs-RGD在PDT作用下能有效抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。本研究進(jìn)一步將QDs-RGD探針注射入胰腺癌移植瘤裸鼠模型體內(nèi)，成功實(shí)現(xiàn)了瘤體的活體成像，發(fā)現(xiàn)QDs-RGD探針的聚集特異性和聚集時(shí)間明顯優(yōu)于單純QDs探針。由此可見，RGD偶聯(lián)可使QDs更具有靶向性，能將之精確輸送至腫瘤組織內(nèi)，從而提高PDT的有效性。

吉西他濱是治療晚期胰腺癌的首選化療藥物。研究[12-13]顯示，PDT在體外不僅能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡，還能減少胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的耐藥性。Xie等[14]以photosan作為PDT光敏劑聯(lián)合吉西他濱治療胰腺癌，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥的療效較單一用藥顯著且起效快、維持時(shí)間長，能減少腫瘤復(fù)發(fā)。本研究采用QDs-RGD探針作為光敏劑，探討PDT聯(lián)合吉西他濱對(duì)裸鼠胰腺癌移植瘤的生長抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDT組、吉西他濱組和聯(lián)合治療組的瘤重、瘤體積均顯著低于對(duì)照組和單純光照組，其中聯(lián)合治療組又顯著低于PDT組和吉西他濱組，且聯(lián)合治療組的抑瘤率高于PDT組和吉西他濱組，提示以QDs-RGD為光敏劑的PDT聯(lián)合吉西他濱可顯著提高抑瘤效果。

關(guān)于PDT抑制胰腺腫瘤細(xì)胞的具體機(jī)制，本研究組在前期研究[15]中已初步進(jìn)行探討，研究以PDT體外作用于胰腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞髓樣細(xì)胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1, Mcl-1)表達(dá)減少，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)表達(dá)增多，該兩種基因與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。經(jīng)PDT治療的胰腺癌細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，而后者是線粒體損傷和凋亡的激活劑，加之胰腺癌細(xì)胞清除氧自由基的能力降低，故ROS對(duì)腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生抑制作用。此外，PDT還能顯著改變胰腺癌細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，增強(qiáng)其氧化應(yīng)激水平[16]。然而，吉西他濱與PDT協(xié)同抗腫瘤的作用機(jī)制尚未明確，有待后續(xù)進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，本研究采用QDs-RGD探針作為光敏劑，在PDT治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合吉西他濱化療，發(fā)現(xiàn)該聯(lián)合療法對(duì)祼鼠體內(nèi)胰腺癌移植瘤的生長有明顯抑制作用，為臨床治療胰腺癌提供了一條新思路。然而，相關(guān)作用機(jī)制仍未明確，有待后續(xù)研究進(jìn)行深入探討和驗(yàn)證。

1 Desgrosellier JS, Cheresh DA. Integrins in cancer: biological implications and therapeutic opportunities[J]. Nat Rev Cancer, 2010, 10 (1): 9-22.

2 Liu S. Radiolabeled multimeric cyclic RGD peptides as integrin alphavbeta3 targeted radiotracers for tumor imaging[J]. Mol Pharm, 2006, 3 (5): 472-487.

3 Cai W, Shin DW, Chen K, et al. Peptide-labeled near-infrared quantum dots for imaging tumor vasculature in living subjects[J]. Nano Lett, 2006, 6 (4): 669-676.

4 Jemal A, Siegel R, Xu J, et al. Cancer statistics, 2010[J]. CA Cancer J Clin, 2010, 60 (5): 277-300.

5 Heinemann V. Present and future treatment of pancreatic cancer[J]. Semin Oncol, 2002, 29 (3 Suppl 9): 23-31.

6 Chua YJ, Cunningham D. Adjuvant treatment for resectable pancreatic cancer[J]. J Clin Oncol, 2005, 23 (20): 4532-4537.

7 李踐. 光動(dòng)力學(xué)療法治療癌癥[J]. 中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào), 2005, 24 (2): 237-239.

8 Jain KK. Nanodiagnostics: application of nanotechnology in molecular diagnostics[J]. Expert Rev Mol Diagn, 2003, 3 (2): 153-161.

9 Akerman ME, Chan WC, Laakkonen P, et al. Nanocrystal targetinginvivo[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99 (20): 12617-12621.

10 Cai W, Chen X. Preparation of peptide-conjugated quantum dots for tumor vasculature-targeted imaging[J]. Nat Protoc, 2008, 3 (1): 89-96.

11 Zhou M, Ni QW, Yang SY, et al. Effects of integrin-targeted photodynamic therapy on pancreatic carcinoma cell[J]. World J Gastroenterol, 2013, 19 (39): 6559-6567.

12 Yu Z, Huang KH, Zhong W, et al.Invitrolethal effect of photodynamic therapy on human pancreatic cancer cells and its major influencing factors[J]. Clin Oncol Cancer Res, 2011, 8 (3): 155-162.

13 Celli JP, Solban N, Liang A, et al. Verteporfin-based photodynamic therapy overcomes gemcitabine insensitivity in a panel of pancreatic cancer cell lines[J]. Lasers Surg Med, 2011, 43 (7): 565-574.

14 Xie Q, Jia L, Liu YH, et al. Synergetic anticancer effect of combined gemcitabine and photodynamic therapy on pancreatic cancerinvivo[J]. World J Gastroenterol, 2009, 15 (6): 737-741.

15 Wang L, Yang W, Read P, et al. Tumor cell apoptosis induced by nanoparticle conjugate in combination with radiation therapy[J]. Nanotechnology, 2010, 21 (47): 475103.

16 Luo G, Long J, Zhang B, et al. Quantum dots in cancer therapy[J]. Expert Opin Drug Deliv, 2012, 9 (1): 47-58.