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(寧波市江北區(qū)畜牧獸醫(yī)站，浙江寧波 315020)

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卵黃替代血清檢測產(chǎn)蛋鴨高致病性禽流感免疫抗體水平的可行性研究

范文穎，周寅，顧祥國

(寧波市江北區(qū)畜牧獸醫(yī)站，浙江寧波 315020)

為探討以卵黃替代血清檢測產(chǎn)蛋鴨高致病性禽流感免疫抗體水平的可行性，對小群體試驗(yàn)鴨，每隔7 d采集卵黃樣品和對應(yīng)的血清樣品，持續(xù)3個(gè)月，以HI方法檢測兩者高致病性禽流感病毒疫苗(H5 RE-6株)免疫抗體水平，對檢測結(jié)果進(jìn)行差異性及相關(guān)性研究。結(jié)果表明，卵黃與對應(yīng)的血清免疫抗體水平差異不顯著，具有較強(qiáng)相關(guān)性。同時(shí)進(jìn)行田間大樣本檢測，從30家蛋鴨養(yǎng)殖戶每家隨機(jī)采集30枚蛋和20份全血樣品，對檢測結(jié)果進(jìn)行kappa檢驗(yàn)，表明卵黃和血清對判定群體免疫抗體水平具有一致性。

卵黃；禽流感；免疫抗體；蛋鴨

我國規(guī)定對養(yǎng)殖禽類的高致病性禽流感實(shí)行強(qiáng)制免疫，檢測高致病性禽流感免疫抗體是基層動物防疫監(jiān)督部門的重要工作。一般通過檢測禽類血清中高致病性禽流感抗體水平，進(jìn)行免疫效果評估。這種方法在采血時(shí)必須對家禽進(jìn)行抓捕、穿刺抽血等操作，易對蛋禽造成驚嚇等應(yīng)激而引起群體性產(chǎn)蛋量降低，使養(yǎng)殖戶蒙受經(jīng)濟(jì)損失，養(yǎng)殖戶普遍不愿配合，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，采樣效率不高。

本研究使用經(jīng)篩選后的鴨卵黃禽流感抗體檢測方法(效價(jià)與血清抗體較一致)對小群體試驗(yàn)鴨和田間樣本的卵黃分別進(jìn)行卵黃抗體效價(jià)檢測，并與血清抗體效價(jià)進(jìn)行相關(guān)性和一致性檢驗(yàn)，以確定用檢測卵黃抗體代替血清抗體對產(chǎn)蛋鴨進(jìn)行高致病性禽流感免疫評估的可行性。

1 試驗(yàn)材料

1.1 疫苗 重組二價(jià)禽流感病毒滅活疫苗(H5+H9亞型)。批號：2012043，乾元浩生物股份有限公司鄭州生物廠生產(chǎn)。

1.2 HI試驗(yàn)用抗原和血清 高致病性禽流感病毒(H5N1亞型RE-6株)抗原和血清。哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)，批號為20130218。

1.3 試驗(yàn)動物

1.3.1 從寧波江北區(qū)某種鴨場選取個(gè)體差異不顯著的產(chǎn)蛋鴨20羽(180日齡)，經(jīng)H5N1禽流感疫苗三次免疫，放入試驗(yàn)鴨舍采用常規(guī)方法飼養(yǎng)，作為小群試驗(yàn)鴨。

1.3.2 寧波市江北區(qū)30家存欄蛋鴨2000羽以上蛋鴨場中的產(chǎn)蛋鴨群(紹興麻鴨)，每家隨機(jī)采集蛋30枚和全血樣品20份，進(jìn)行田間大樣本檢測。

1.4 儀器及試劑 96孔V型微量反應(yīng)板、微量移液器、漩渦震蕩器、微量振蕩器、離心機(jī)、無菌采血器等及1%雞紅細(xì)胞懸液，生理鹽水。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品采集 試驗(yàn)蛋鴨于180日齡(產(chǎn)蛋穩(wěn)定)開始采樣，每隔7 d采集1次血清，每天收集鴨蛋，采血當(dāng)天產(chǎn)蛋作為檢測用蛋(20枚)。試驗(yàn)期3個(gè)月，至260日齡左右結(jié)束，共采樣12次。

田間大樣本采自30家蛋鴨養(yǎng)殖場，每場隨機(jī)采集當(dāng)天產(chǎn)的鴨蛋30枚和全血樣品20份，編號記錄，要求按場戶對應(yīng)。

2.2 樣品制備

2.2.1 血清樣品制備 無菌采集蛋鴨翅或肢靜脈血，靜置后吸取析出血清。保存待檢。

2.2.2 卵黃樣品制備 將卵黃與蛋清分離，用無菌采血器刺破卵膜，直接從卵黃囊抽取卵黃。將采集的卵黃與等量生理鹽水作1∶1稀釋，混合制成卵黃檢樣備用。

2.3 HI抗體效價(jià)測定 血清樣品按《GB/T 18936-2003高致病性禽流感診斷技術(shù)》規(guī)定方法檢測。卵黃生理鹽水稀釋樣品參照血清樣品進(jìn)行HI效價(jià)測定。

3 結(jié)果與分析

3.1 小群體試驗(yàn)鴨卵黃與血清HI抗體效價(jià)的差異性比較 詳見表1。

表1 小群體試驗(yàn)鴨卵黃與血清HI抗體效價(jià)結(jié)果

由表1可見，在單獨(dú)籠養(yǎng)試驗(yàn)點(diǎn)的240組蛋鴨卵黃與對應(yīng)血清HI抗體效價(jià)檢測中，卵黃與血清抗體滴度相差在±1log2以內(nèi)的有230組，符合率在95%以上。利用spss12.0軟件對12批次的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，差異不顯著(t0.05)。據(jù)試驗(yàn)可知，在產(chǎn)蛋鴨180～260日齡內(nèi)，卵黃抗體與血清抗體差異不顯著，可以采用卵黃替代血清進(jìn)行免疫抗體檢測。

3.2 小群體試驗(yàn)鴨卵黃—血清抗體效價(jià)消長規(guī)律及相關(guān)性分析 詳見圖1。

圖1 小群體試驗(yàn)鴨卵黃與血清HI抗體效價(jià)結(jié)果

由圖1可見，試驗(yàn)期間卵黃與血清抗體效價(jià)均值較為接近，同升同降，曲線變化較為一致，利用spss12.0軟件進(jìn)行相關(guān)系數(shù)分析(r=0.63>r0.05，P<0.05)，表明兩者具有強(qiáng)相關(guān)性。

在整個(gè)試驗(yàn)期間，卵黃和血清抗體效價(jià)均維持在較高水平(>5log2)，表明經(jīng)過三免高致病性禽流感疫苗后的有效抗體維持水平可達(dá)260日齡后，基本覆蓋了整個(gè)產(chǎn)蛋期。

3.3 田間大樣本檢測對兩種方法的一致性檢驗(yàn) 詳見表2。

表2 田間大樣本檢測卵黃與血清抗體陽性率檢測結(jié)果

由表2可見，以陽性率70%以上作為群體免疫合格標(biāo)準(zhǔn)，對30家養(yǎng)殖場數(shù)據(jù)進(jìn)行整理歸類，經(jīng)一致性kappa檢驗(yàn)(k=0.782>0.75)，表明在不同產(chǎn)蛋期間用卵黃抗體的陽性率評估蛋鴨群體免疫合格與血清評估具有良好的一致性。

4 結(jié)果與討論

不少國內(nèi)學(xué)者對卵黃抗體效價(jià)與血清抗體效價(jià)的相關(guān)性進(jìn)行過初步研究，孟艷等(2007)[1]、席文平等(2007)[2]研究均認(rèn)為蛋雞卵黃抗體效價(jià)與血清效價(jià)的差異不顯著，具有相關(guān)性。但有關(guān)蛋鴨卵黃與血清抗體相關(guān)性研究報(bào)道甚少，本研究可為卵黃取代血清作為蛋鴨禽流感抗體檢測樣本提供了依據(jù)。

實(shí)際操作中，卵黃樣品需經(jīng)制備才能用HI方法檢測。研究者利用很多方法對卵黃樣品進(jìn)行提純制備，如氯仿萃取法[3]、PBS直接稀釋法[4]、PEG沉淀法[5]。從抗體檢測簡便實(shí)用角度出發(fā)，筆者經(jīng)過篩選，采用生理鹽水直接稀釋卵黃樣品，檢測效價(jià)與血清效價(jià)差異不顯著，且重復(fù)性良好。

據(jù)黃建文等(2004)[6]報(bào)道，在蛋雞禽流感疫苗免疫后的21 d內(nèi)不適宜采用卵黃替代血清監(jiān)測禽流感抗體，因?yàn)槁腰S中抗體產(chǎn)生較血液中抗體產(chǎn)生滯后。但在養(yǎng)殖戶實(shí)際飼養(yǎng)過程中，很少在產(chǎn)蛋期間進(jìn)行免疫接種，一般均在開產(chǎn)前1個(gè)月就已做好三免工作。因此，在實(shí)際檢測工作中無論在產(chǎn)蛋初期、中期、還是后期，均可采用卵黃替代血清檢測禽流感抗體。

本次試驗(yàn)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對小群體試驗(yàn)鴨的卵黃與對應(yīng)血清的免疫抗體效價(jià)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩種抗體效價(jià)差異不顯著，具有較強(qiáng)相關(guān)性，可以用卵黃替代血清進(jìn)行檢測。田間大樣本檢測結(jié)果表明，在不同產(chǎn)蛋期間實(shí)際操作中卵黃和血清對判定群體免疫水平具有一致性，再次驗(yàn)證了在產(chǎn)蛋期可以采用卵黃替代血清樣品進(jìn)行檢測。

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2014-01-15

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