賀黌裕 張宏偉

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院 a重癥監(jiān)護(hù)室，b普外科，上海 200032)

SLC22A18(solute carrier family 22, member 18)是位于人類(lèi)染色體11p15.5的父源印記基因，與細(xì)胞的代謝和生長(zhǎng)有關(guān)[1]。SLC22A18的表達(dá)異常與胚胎性腫瘤及多種實(shí)體腫瘤(如肺癌、肝癌等)相關(guān)。多項(xiàng)研究[2-4]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中SLC22A18表達(dá)異常，SLC22A18可能作為抑癌基因影響乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究檢測(cè)了SLC22A18在2種乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231(惡性程度高)和MCF-7(惡性程度低)中的表達(dá)水平，并采用Transwell法研究這2種乳腺癌細(xì)胞株侵襲轉(zhuǎn)移能力的差異。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 兔抗人SLC22A18抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech Group公司，Transwell小室(濾膜孔徑:8.0 μm)購(gòu)自美國(guó)Corning公司，Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基、10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、L15培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Giemsa染色液購(gòu)自江蘇省南京建成公司。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備 PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，光學(xué)顯微鏡及攝像系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.3 細(xì)胞來(lái)源與培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和MCF-7均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海分院。MDA-MB-231細(xì)胞株用含10% FBS的L15培養(yǎng)基培養(yǎng)，MCF-7細(xì)胞株培養(yǎng)用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，2種細(xì)胞的培養(yǎng)條件均為37 ℃、5%CO2以及飽和濕度。每1～2 d傳代。

1.4 Transwell過(guò)程 預(yù)先準(zhǔn)備4 ℃預(yù)冷的槍頭、EP管、Transwell小室和24孔板，實(shí)驗(yàn)過(guò)程在冰上完成；將50 mg/L Matrigel與無(wú)血清培養(yǎng)液按1∶8體積混勻，用以包被Transwell小室底部膜的上室面，24孔板每孔用量為50 μL； 37 ℃放置約1 h ，使Matrigel聚合成凝膠；接種細(xì)胞， 培養(yǎng)60 h后觀察結(jié)果；計(jì)數(shù)6個(gè)視野(200×)，取平均值。

1.5 檢測(cè)2種細(xì)胞株中SLC22A18的 mRNA和蛋白的表達(dá)情況 采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)2種細(xì)胞株中SLC22A18 mRNA的表達(dá)情況：根據(jù)樣品Ct值計(jì)算出MDA-MB-231細(xì)胞株和MCF-7細(xì)胞株中SLC22A18 mRNA的表達(dá)量。采用Western blotting法檢測(cè)2種細(xì)胞株中SLC22A18蛋白的表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，SLC22A18 的mRNA和蛋白的表達(dá)水平的比較采用t檢驗(yàn)，Transwell結(jié)果的比較采用秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Transwell結(jié)果 MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞穿過(guò)Matrigel膠的細(xì)胞染色結(jié)果見(jiàn)圖1，穿過(guò)Matrigel膠的MDA-MB-231細(xì)胞Giemsa染色呈藍(lán)紫色、梭形；穿過(guò)Matrigel膠的MCF-7細(xì)胞Giemsa染色呈紫紅色、圓形。MDA-MB-231和MCF-7穿過(guò)Matirgel膠的平均細(xì)胞數(shù)分別為59.333個(gè)和20.000個(gè)；2組數(shù)據(jù)樣本呈偏態(tài)分布，秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。由此表明，MDA-MB-231和MCF-7的侵襲能力有差異，惡性程度高的MDA-MB-231細(xì)胞株侵襲能力強(qiáng)，惡性程度低的MCF-7細(xì)胞株侵襲能力弱。見(jiàn)圖1。

圖1乳腺癌細(xì)胞株穿過(guò)Matrigel膠的細(xì)胞染色結(jié)果(×200)，白色箭頭為已穿透膜的細(xì)胞

2.2 SLC22A18的 mRNA和蛋白的表達(dá) 惡性程度高的MDA-MB-231細(xì)胞株中SLC22A18 的mRNA和蛋白表達(dá)水平較低，惡性程度低的MCF-7細(xì)胞株中SLC22A18 的mRNA和蛋白表達(dá)水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2乳腺癌細(xì)胞株SLC22A18mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)

3 討 論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全球范圍內(nèi)，每年有120萬(wàn)乳腺癌新發(fā)病例，危及10%～12%的女性人群，每年有50萬(wàn)女性死于乳腺癌[5]。乳腺癌嚴(yán)重威脅婦女的健康，是女性因腫瘤導(dǎo)致死亡的首要原因，而乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移則是導(dǎo)致患者死亡的首要原因。

以往關(guān)于腫瘤的的分子生物學(xué)研究多集中于基因的突變、序列的改變。然而，基因的表達(dá)除取決于DNA序列信息外，還取決于DNA甲基化、基因組印記等不涉及DNA序列的可遺傳的表達(dá)調(diào)控方式，這是目前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。

基因組印記是指特定親本的等位基因或其所在染色體在配子或受精卵中發(fā)生表觀遺傳學(xué)修飾，結(jié)果導(dǎo)致該基因的2個(gè)等位基因在其后代的子細(xì)胞中表達(dá)程度不同?；蚪M印記決定了性狀的遺傳不遵循孟德?tīng)柖桑憩F(xiàn)為單親依賴(lài)性遺傳?；蚪M印記在進(jìn)化論意義上可能有防止單性生殖、維持遺傳多樣性的優(yōu)勢(shì)，但也增加了隱性突變轉(zhuǎn)為顯性的危險(xiǎn)性。由于印記基因相當(dāng)于功能上的單倍體，單次突變就可使該基因失活，故可能導(dǎo)致疾病或腫瘤[6-7]。

印記基因?qū)е履[瘤的機(jī)制主要有以下幾方面[8]：(1)印記獲得。原本雙表達(dá)的基因中有1個(gè)等位基因異常沉默，從而獲得了印記的特征，相當(dāng)于功能上的單倍體，在某種程度上與雜合性缺失和單親二倍體相似，使罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加；(2) 失印記。促生長(zhǎng)基因或癌基因的2個(gè)等位基因中的1個(gè)被印記沉寂，另1個(gè)正常表達(dá)，若印記的等位基因發(fā)生印記丟失(loss of imprinting，LOI)，導(dǎo)致雙等位基因表達(dá)，基因產(chǎn)物成倍增加，從而參與腫瘤的發(fā)生。如啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的印記基因發(fā)生LOI，被印記的等位基因重新激活，可導(dǎo)致該基因過(guò)度表達(dá)，利于腫瘤生長(zhǎng)。

SLC22A18，或稱(chēng)TSSC5/IMPT1/BWR1A/ORCTL2，是位于人類(lèi)染色體11p15.5的父源印記基因，與藥物敏感性、細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)有關(guān)[1]。SLC22A18蛋白水平可能受泛素-蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)[9]。SLC22A18亦是成人肺腫瘤抑制基因和胎兒腎印記性腫瘤抑制基因[10]。研究[2-4]發(fā)現(xiàn)，人乳腺癌細(xì)胞中存在SLC22A18基因的突變，肝癌、乳腺癌中存在SLC22A18基因的印記獲得。

本研究發(fā)現(xiàn)，惡性程度較高的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231侵襲能力強(qiáng)，細(xì)胞中SLC22A18表達(dá)量較少；惡性程度低的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7侵襲能力弱，細(xì)胞中SLC22A18表達(dá)量較多；這說(shuō)明，印記基因SLC22A18有可能作為抑癌基因影響乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。SLC22A18在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)的機(jī)制可能與基因發(fā)生突變或印記獲得有關(guān)。

綜上所述，SLC22A18的 mRNA和蛋白水平在惡性程度不同的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和MCF-7中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SLC22A18與乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力有關(guān)，可能作為抑癌基因影響乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

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