陳斌 童朝陽(yáng) 施東偉

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院急診科，上海 200032)

膿毒癥是臨床常見的危重病癥，嚴(yán)重膿毒癥?？蓪?dǎo)致多器官功能衰竭綜合征(multiple organ distress syndrome，MODS)。國(guó)內(nèi)外均有臨床研究[1-2]表明，心肌損傷是嚴(yán)重膿毒癥時(shí)最常見的并發(fā)癥之一，是膿毒癥患者預(yù)后不良的重要原因。然而，目前有關(guān)膿毒癥致心肌損傷的機(jī)制及干預(yù)方法的研究尚不多見。本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture，CLP)建立大鼠膿毒癥模型，然后早期應(yīng)用還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)進(jìn)行干預(yù)治療，觀察GSH對(duì)大鼠血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB)水平和心肌組織Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)mRNA表達(dá)的影響，旨在探討GSH對(duì)膿毒癥致急性心肌損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 主要儀器和試劑 自動(dòng)生化分析儀(VITROS 950，美國(guó)強(qiáng)生公司)；高速冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5417R，德國(guó)Eppendorf公司)；實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence reverse transcription-polymerase chain reaction，PCR)儀(Illumina Eco，美國(guó)Illumina公司)；752型紫外分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；GSH(阿拓莫蘭，重慶藥友制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：0909020)；Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、RNA酶抑制劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；所有引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房提供，體質(zhì)量200～250 g。按照隨機(jī)數(shù)字表將大鼠隨機(jī)分為4組。正常組(Normal組，n=6)：不行CLP術(shù)且未注射藥物；假手術(shù)組(Sham組，n=18)：僅行剖腹手術(shù)，不行CLP術(shù)，術(shù)后尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液0.1 mL；膿毒癥組(CLP組，n=18)：行CLP術(shù)，術(shù)后尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液0.1 mL；GSH干預(yù)組(GSH+CLP組，n=18)：行CLP術(shù)，術(shù)后尾靜脈注射GSH(60 mg/kg)0.1 mL。除正常組外每組大鼠再按術(shù)后6 h、12 h、24 h分為3個(gè)亞組(n=6)，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集血清及大鼠心臟組織標(biāo)本，所有大鼠均于血標(biāo)本采集完畢后處死。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之前死亡的大鼠被排除在研究之外。

1.3 膿毒癥模型的制作 采用CLP術(shù)制作大鼠膿毒癥模型。大鼠手術(shù)前晚禁食不禁水，采用3%戊巴比妥鈉(40～50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，于腹正中線行1.5～2.0 cm的縱行切口，充分暴露盲腸，在盲腸末端距離回盲瓣約5 mm處結(jié)扎，但不能影響腸道的通暢性。然后用18號(hào)針頭行盲腸穿刺2次，輕輕擠壓盲腸，使少量盲腸內(nèi)容物溢出。原位回納盲腸，逐層縫合關(guān)腹。各組術(shù)后均按50 mL/kg(體質(zhì)量)皮下注射0.9%氯化鈉溶液來補(bǔ)充液體流失。各亞組大鼠分別在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采用頸動(dòng)脈置管抽血后處死，收集心臟組織標(biāo)本待測(cè)。

1.4 標(biāo)本檢測(cè) 取血清標(biāo)本1 mL，采用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清CK-MB水平；取部分心臟組織標(biāo)本，采用RT-PCR法檢測(cè)心肌組織中TLR4的mRNA表達(dá)；取另一部分心臟組織標(biāo)本，置入10%中性甲醛溶液中固定8 h以上，然后石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察病理組織學(xué)改變。

2 結(jié) 果

2.1 CLP術(shù)及GSH對(duì)大鼠血清CK-MB的影響 Sham組和Normal組術(shù)后6 h、12 h、24 h血清CK-MB水平組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Sham組及Normal組比較，CLP組術(shù)后6 h血清CK-MB水平開始升高，12 h達(dá)到高峰，24 h仍明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CLP組比較，GSH+CLP組大鼠術(shù)后6 h血清CK-MB水平有所下降，術(shù)后12 h、24 h血清CK-MB水平較CLP組明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 CLP術(shù)及GSH對(duì)大鼠心肌組織中TLR4 mRNA表達(dá)的影響 Sham組與Normal組大鼠術(shù)后6 h、12 h、24 h心肌組織中TLR4 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Sham組及Normal組比較，CLP組術(shù)后6 h心肌組織中TLR4 mRNA表達(dá)開始升高，12 h達(dá)到高峰，24 h仍明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CLP組比較，GSH+CLP組大鼠術(shù)后6 h心肌組織中TLR4 mRNA表達(dá)有所下降，術(shù)后12 h、24 h心肌組織中TLR4 mRNA表達(dá)較CLP組有明顯的下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 組織病理學(xué)結(jié)果 Normal組和Sham組大鼠術(shù)后24 h心肌組織肌纖維結(jié)構(gòu)排列緊密，無充血水腫，未見明顯異常改變；CLP組術(shù)后24 h心肌病理檢查可見肌纖維結(jié)構(gòu)排列疏松紊亂，間質(zhì)充血水腫，大量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞腫脹，可見空泡狀變性等改變；GSH+CLP組大鼠術(shù)后24 h心肌組織上述病理學(xué)損傷性改變均顯著輕于CLP組。見圖1。

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血清CK-MB水平的變化

表2 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)心肌組織TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化

A：Normal組；B：Sham組；C：CLP組；D：GSH+CLP組

3 討 論

膿毒癥的本質(zhì)是全身炎性反應(yīng)綜合征(syste-mic inflammatory response syndrome，SIRS)。免疫調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物Toll樣受體是炎性信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)中最重要的跨膜受體蛋白，在膿毒癥免疫反應(yīng)機(jī)制中起著重要作用。Toll樣受體家族中TLR4受體存在于心肌、脾、淋巴細(xì)胞中，是革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的受體。有研究[3]表明，在膿毒癥中，LPS可以通過形成LPS-LPS結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)復(fù)合物與TLR4受體結(jié)合，將LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，繼而激活核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號(hào)通路，啟動(dòng)多種炎性因子的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

本研究采用CLP術(shù)成功建立膿毒癥模型，結(jié)果顯示，CLP組與Sham組、Normal組比較，術(shù)后6 h血清CK-MB水平開始升高，12 h達(dá)到高峰，24 h仍明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示CLP術(shù)后大鼠出現(xiàn)了明顯的心肌損傷。HE染色顯示，CLP術(shù)后24 h心肌組織出現(xiàn)了明顯的病理組織學(xué)損傷，膿毒癥致大鼠急性心肌損傷模型制作成功。與Sham組及Normal組比較，CLP組術(shù)后6 h心肌組織中TLR4 mRNA表達(dá)開始升高，12 h達(dá)到高峰，24 h仍明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示在膿毒癥早期LPS可誘導(dǎo)心肌組織TLR4 mRNA的表達(dá)，而心肌組織TLR4 mRNA的高表達(dá)可激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)多種炎性因子的產(chǎn)生和釋放而導(dǎo)致心肌損傷。

GSH含有巰基，可參與體內(nèi)氧化還原過程，拮抗氧化劑對(duì)巰基的破壞，保護(hù)細(xì)胞膜，同時(shí)它還能夠?qū)棺杂苫鶎?duì)重要臟器的損害。因此，目前在臨床上GSH可用于各種原因?qū)е碌母闻K損傷的治療。近年來，GSH用于嚴(yán)重膿毒癥致多器官功能損傷干預(yù)的研究已引起學(xué)術(shù)界的重視。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[4]提示，在膿毒癥早期應(yīng)用GSH對(duì)膿毒癥急性肝損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是與降低肝組織TLR4水平有關(guān)。還有研究[5]提示，GSH能抑制急性肺損傷時(shí)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)水平，清除氧自由基，從而對(duì)急性肺損傷起保護(hù)作用。但是，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于GSH在膿毒癥急性心肌損傷中應(yīng)用的研究報(bào)告尚不多見。

本研究結(jié)果顯示，大鼠CLP術(shù)后出現(xiàn)了明顯的心肌損傷，心肌組織TLR4 mRNA高表達(dá)；而如CLP術(shù)后早期應(yīng)用GSH，大鼠6 h、12 h和24 h血清CK-MB水平顯著下降，心肌組織中TLR4 mRNA的表達(dá)水平也明顯降低，其24 h的心肌組織病理學(xué)損傷性改變也明顯減輕。這提示在膿毒癥早期應(yīng)用GSH干預(yù)對(duì)膿毒癥急性心肌損傷具有保護(hù)作用，其可能是通過抑制心肌組織中TLR4 mRNA的表達(dá)，繼而抑制下游炎性因子的釋放，從而減輕炎性反應(yīng)導(dǎo)致的急性心肌損傷。

綜上所述，膿毒癥早期心肌組織TLR4 mRNA的高表達(dá)在膿毒癥急性心肌損傷中起著重要的作用，而在膿毒癥早期應(yīng)用GSH干預(yù)可抑制心肌組織TLR4 mRNA的表達(dá)，繼而抑制下游炎性因子的釋放，從而對(duì)膿毒癥致急性心肌損傷起保護(hù)作用。

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