鄒健 孫麗華 孟亞紅 范小紅 王雪蓮 程韻楓,2

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院血液科，上海 201700；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血液科，上海 200032)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種惡性單克隆漿細(xì)胞疾病，發(fā)病率位居血液系統(tǒng)惡性腫瘤的第2位[1]。近年來，新型靶向藥物的應(yīng)用使MM患者的預(yù)后有了一定程度的改善。研究[2-4]發(fā)現(xiàn)，MM患者可能因淋巴細(xì)胞表型和功能的異常，導(dǎo)致細(xì)胞免疫監(jiān)視功能缺陷，免疫系統(tǒng)對惡變細(xì)胞的清除能力下降。本研究通過檢測32例初診MM患者外周血T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)比例以及血清中白蛋白(albumin，Alb)、β2微球蛋白(β2 microglobulin，β2-MG)的濃度，探討MM患者的免疫功能狀態(tài)及其與腫瘤負(fù)荷、病情進(jìn)展、預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院血液科2011年1月—2013年7月收治的初診MM患者32例，年齡46～80歲，中位年齡65歲；其中男性16例，女性16例；均符合MM診斷標(biāo)準(zhǔn)；按照國際分期系統(tǒng)(International Staging System，ISS)分期，32例中Ⅰ期4例、Ⅱ期12例、Ⅲ期16例。 選擇健康獻(xiàn)血者24例，其中男性14例，女性10例；年齡40～78歲，中位年齡64歲。所有研究對象采血時均無急慢性感染、其他腫瘤及自身免疫性疾病，且未行化療。

1.2 方法 抽取研究對象清晨空腹靜脈血4 mL，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD19+淋巴細(xì)胞以及NK細(xì)胞、CD4+CD25+Treg細(xì)胞的比例。取外周血100 μL，置于流式檢測管中，分別加入不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體各20 μL，4 ℃暗室孵育30 min后，每管加入本實(shí)驗(yàn)室配制的溶血素3000 μL，充分混勻后室溫孵育12 min，1000 r/min離心5 min，棄上清液，加鞘液500 μL，應(yīng)用美國BD公司生產(chǎn)的FACS Aria II Cell Sorter流式細(xì)胞儀檢測，采用Cell quest軟件分析數(shù)據(jù)。分別采用溴甲酚綠法、透射免疫比濁法檢測患者血清Alb、β2-MG水平。

2 結(jié) 果

2.1 外周血淋巴細(xì)胞亞群比例的分析 與健康獻(xiàn)血者相比，MM患者外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞比例的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，CD8+T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞比例升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CD4+/CD8+T淋巴比值、CD19+B淋巴細(xì)胞比例降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 初診MM患者與健康獻(xiàn)血者外周血淋巴細(xì)胞亞群的比例比較

2.2 MM患者外周血Treg細(xì)胞比例及其與臨床分期、β2-MG、Alb的相關(guān)性分析 MM患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例[(6.56±1.98)%]較健康獻(xiàn)血者[(4.35±1.35)%]明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；該比例隨臨床分期增加呈升高趨勢，Ⅰ期為(5.32±0.32)%，Ⅱ期為(8.17±1.03)%，Ⅲ期為(9.64±2.01)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且與β2-MG濃度呈正相關(guān)(P<0.05)，與Alb濃度無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

3 討 論

MM是來源于B細(xì)胞的惡性漿細(xì)胞疾病。研究[3]發(fā)現(xiàn)，MM患者除了有體液免疫功能缺陷，其細(xì)胞免疫功能也有異常，尤其是T淋巴細(xì)胞的表型和功能異常。Goodyear等[5]研究發(fā)現(xiàn)，MM患者的CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)受到抑制，而CD8+T淋巴細(xì)胞一般正常，導(dǎo)致CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值下降；CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值與疾病分期和治療相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與健康人比較，MM患者外周血淋巴細(xì)胞中CD8+、NK細(xì)胞比例升高；CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值、CD19+B淋巴細(xì)胞比例降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。因此，T細(xì)胞亞群的各種改變可能是MM患者原發(fā)免疫應(yīng)答缺陷的原因之一，且影響預(yù)后。

CD4+CD25+Treg細(xì)胞是一群具有免疫負(fù)調(diào)控功能的T細(xì)胞亞群，在維持對自身成分免疫耐受的同時，也可阻止機(jī)體對自身同源腫瘤細(xì)胞的免疫，導(dǎo)致腫瘤的免疫抑制及免疫逃逸。Feyler等[2]研究發(fā)現(xiàn)，MM患者外周血Treg細(xì)胞比例增加，且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，MM患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例明顯升高，與Feyler等[2]的研究相符。但是，也有研究[6]發(fā)現(xiàn)，MM患者CD4+CD25+Treg細(xì)胞存在功能缺陷。Treg細(xì)胞在MM中的具體作用尚需進(jìn)一步研究。

ISS分期是一種與MM預(yù)后相關(guān)的分期系統(tǒng)。MM患者的β2-MG水平與腫瘤負(fù)荷及預(yù)后有關(guān)。本研究顯示，MM患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例在疾病各期均高于健康獻(xiàn)血者，并與臨床分期呈正相關(guān)，其與β2-MG濃度也呈正相關(guān)(P<0.05)，提示CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例，與MM腫瘤負(fù)荷、病情預(yù)后相關(guān)，是預(yù)后不良的影響因素。也有研究[7]顯示，CD4+CD25+Treg細(xì)胞還能反映疾病的活動程度。

綜上所述，本研究初步分析了MM患者外周血中淋巴細(xì)胞亞群的水平，結(jié)果提示，T細(xì)胞亞群異常是MM患者原發(fā)免疫應(yīng)答缺陷的原因之一；MM患者CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例異常升高，提示Treg細(xì)胞在免疫抑制中發(fā)揮作用，導(dǎo)致MM免疫逃逸，并同腫瘤負(fù)荷、病情進(jìn)展、預(yù)后有關(guān)。此結(jié)論有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入驗(yàn)證。

[1]郭秀臣,全麗娜,李紅,等.多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓中Treg細(xì)胞與預(yù)后相關(guān)性研究[J].實(shí)用腫瘤學(xué)雜志,2014,28(1):54-58.

[2]Feyler S,Scott GB,Parrish C,et al.Tumour cell generation of inducible regulatory T-cells in multiple myeloma is contact-dependent and antigen-presenting cell-independent[J]. PLoS One,2012,7(5):e35981.

[3]Shen CJ,Yuan ZH,Liu YX,et al.Increased numbers of T helper 17 cells and the correlation with clinicopathological characteristics in multiple myeloma[J].J Int Med Res,2012,40(2):556-564.

[4]Giannopoulos K,Kaminska W,Hus I,et al.The frequency of T regulatory cells modulates the survival of multiple myeloma patients:detailed characterisation of immune status inmultiple myeloma[J].Br J Cancer,2012,106(3):546-552.

[5]Goodyear OC,Pratt G,McLarnon A,et al.Differential pattern of CD4+and CD8+T-cell immunity to MAGE-A1/A2/A3 in patients with monoclonal gammopathy of undermined significance(MGUS) and multiple myeloma[J]. Blood,2008,112(8):3362-3372.

[6]Feyler S,von Lilienfeld-Toal M,Jarmin S,et al.CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells are increased whilst CD3(+)CD4(-)CD8(-)alphabeta TCR(+) Double Negative T cells are decreased in the peripheral blood of patients with multiple myeloma which correlates with disease burden[J].Br J Haematol,2009,144(5):686-695.

[7]Braga WM,Atanackovic D,Colleoni GW.The role of regulatory T cell and TH17 cells in multiple myeloma[J].Clin Dev Immunol,2012,2012:293479.