施國明 柯愛武 俞靜嫻 胡美玉 張鵬飛 蔡加彬 董兆如 張弛 邱雙健 孫惠川 周儉 樊嘉

(復旦大學附屬中山醫(yī)院肝外科，上海 200032)

CD151基因定位于人類染色體11p15.5，其編碼的蛋白質形成四次跨膜分子結構[1-8]，廣泛分布于人體各類細胞，參與細胞的多種重要生理功能[1, 7, 9]。CD151在肝細胞肝癌(肝癌)等多種惡性腫瘤中均過表達，其表達程度與患者的預后密切相關。CD151與整合素、生長因子結合或自身相互結合而形成的功能復合體，會影響腫瘤細胞遷移、病理血管形成和上皮間質樣轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)等[1-7, 10-11]。我們的前期研究[10]發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞中CD151表達水平的改變可顯著影響肝癌細胞的侵襲和轉移能力；CD151通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)/Snail信號通路而促進基質金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9, MMP9)的分泌和表達，從而促進肝癌新生血管形成[11]；CD151與整合素α6β1在肝癌細胞表面形成復合物，進而選擇性擴大整合素α6β1-PI3K信號，導致核轉錄因子Snail的核聚集與激活，以此促進肝癌發(fā)生EMT[12]；采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, coIP)結合液相色譜串聯(lián)質譜(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS/MS)技術發(fā)現(xiàn)，人肝癌細胞株HCCLM3中CD151與整合素α6β1等分子結合，形成功能復合物[13]。因此，CD151與整合素α6β1等結合形成的功能復合物是抗肝癌復發(fā)/轉移的潛在靶點[9]。本研究應用免疫工程技術制備靶向CD151-整合素α6β1結合域[14]的多克隆抗體并鑒定其免疫學特性。

1 資料與方法

1.1 多肽合成以及實驗動物和細胞株 多肽復合物CGQRDHASNIYKVEG-KLH、CGQRDH ASNIYKVEG-BSA由上海強耀生物科技有限公司合成。6周齡的雄性BALB/c小鼠10只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。肝癌細胞株HCCLM3系復旦大學肝癌研究所建株并保存。

1.2 主要試劑和材料 弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司。細胞培養(yǎng)液DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司。小鼠抗人CD151單克隆抗體購自美國Serotec公司，辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)標記的羊抗鼠二抗、羊抗鼠異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)熒光二抗、4-甲基聯(lián)苯胺(tetramethyl benzidine, TMB)購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 靶向CD151-整合素α6β1結合域的多克隆抗體的制備 將100 μg小鼠多肽復合物CGQRDHASNIYKVEG-KLH與等量完全弗氏佐劑混合后腹腔注射BALB/c小鼠。于第3、5、7周將抗原與不完全弗氏佐劑混合并乳化后腹腔注射小鼠，抗原劑量同前。沖擊免疫后3 d處死小鼠，處死前先從眼球取血。吸取血清，4℃離心10 min，將上層血清分裝至玻璃瓶，-80℃保存。

1.4 抗體效價的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測抗體的效價。取CD151-整合素α6β1-BSA(CGQRD HASNIYKVEG- BSA)連接的抗原5 μg/mL，以100 μL/孔包被96孔ELISA酶標板，4℃過夜。磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗滌3次，每次5 min；然后用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入不同稀釋度(1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶32000、1:64000、1∶128000)的免疫后血清，37℃孵育1 h。加入1∶5000 HRP標記的山羊抗鼠二抗，TMB顯色，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD值(450 nm)。實驗設空白對照孔和陰性對照孔。將待測孔OD值≥對照孔OD值2倍者定為陽性，以陽性最高稀釋倍數(shù)為最終效價。實驗重復3次。

1.5 Western blotting、細胞免疫熒光染色、免疫組織化學染色

1.5.1 Western blotting 取對數(shù)生長期的HCCLM3細胞，裂解后提取蛋白質。Western blotting按常規(guī)進行，新合成多克隆抗體按1∶1000加入，HRP標記羊抗鼠二抗按1∶5000加入，以1∶200商業(yè)化的小鼠抗人CD151單克隆抗體作為陽性對照，實驗重復3次。

1.5.2 細胞免疫熒光染色 以1×104/孔的密度將HCCLM3細胞接種于12孔培養(yǎng)板內預置的蓋玻片上，常規(guī)培養(yǎng)后以4%多聚甲醛固定。按照常規(guī)方法進行細胞免疫熒光染色，加入1∶200新合成的多克隆抗體，4℃過夜；加入1∶200羊抗鼠FITC熒光二抗，DAB顯色；熒光顯微鏡下觀察、攝影。

1.5.3 免疫組織化學染色 在復旦大學肝癌研究所組織庫隨機抽取20例肝癌患者手術切除的肝癌組織，進行石蠟固定后切片、烤片、脫蠟和水化、抗原熱修復、去內源性酶、封閉，加1∶100新合成的多克隆抗體，4℃過夜，加入1∶2000 HRP標記的羊抗鼠二抗，封片，顯微鏡下觀察、攝影。CD151陽性染色的判斷標準參照文獻[10]。

2 結 果

2.1 多克隆抗體的效價測定 免疫后的小鼠血清與抗原多肽復合物CGQRDHASNIYKVEG-KLH呈強陽性反應；隨著血清稀釋倍數(shù)降低，相應的OD值隨之降低；以免疫前血清為陰性對照，經計算多克隆抗體的效價為1∶64000。

2.2 Western blotting結果 用新合成的小鼠抗人多克隆抗體行Western blotting,檢測HCCLM3中CD151蛋白表達,以商業(yè)化的小鼠抗人CD151單克隆抗體作為對照。結果顯示, 用新合成的小鼠抗人多克隆抗體反應時，膜上28 kDa處有條帶顯示，與商業(yè)化小鼠抗人CD151單克隆抗體的條帶一致，見圖1。

2.3 細胞免疫熒光染色 采用細胞免疫熒光染色法，用新合成多克隆抗體檢測肝癌細胞HCCLM3中CD151蛋白定位。結果顯示，肝癌細胞HCCLM3中CD151定位于肝癌細胞膜和細胞漿，見圖2。

2.4 免疫組織化學染色 用新合成多克隆抗體通過免疫組織化學染色法檢測肝癌組織中CD151蛋白的定位、表達。結果顯示，CD151陽性表達于肝癌細胞的細胞膜和胞漿，CD151在癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，見圖3。

A：新合成多克隆抗體；B：商業(yè)化的小鼠抗人CD151單克隆抗體

圖1用新合成多克隆抗體行Westernblotting,檢測肝癌細胞HCCLM3中CD151蛋白表達

A 肝癌細胞膜和細胞漿呈CD151陽性表達；B 細胞核DAPI染色；C 圖片A和B融合后

A 癌旁組織中CD151的表達(×400)；B 癌與癌旁組織交界處CD151的表達(×100)；C 癌組織中CD151的表達 (×400)

3 討 論

目前已知，許多基因參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展，且一些基因在肝癌的侵襲和轉移中起重要作用。CD151是四跨膜蛋白家族中最重要的成員之一，它在人體細胞中分布廣泛，包括上皮細胞、內皮細胞和血小板等，參與細胞的多種重要生理功能，如信號轉導、細胞黏附、細胞移動與形態(tài)改變等[1, 7, 9]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，CD151可通過多種途徑促進肝癌的侵襲和轉移，包括(1)影響肝癌細胞的侵襲性[10]；(2)通過激活PI3K/Akt/GSK-3β/Snail信號通路促進MMP9的分泌和表達，促進肝癌新生血管形成[11]；(3)與整合素α6β1在肝癌細胞表面形成復合物，選擇性擴大整合素α6β1/PI3K信號，促進肝癌發(fā)生EMT[12]等。因此，CD151是影響肝癌轉移復發(fā)的關鍵蛋白，與整合素α6β1等結合所形成的功能復合體是抗腫瘤復發(fā)/轉移的潛在靶點[9]。

已有抗人CD151抗體用于腫瘤治療的實驗研究報道[15]。但這些研究在制備抗體時未考慮到CD151在腫瘤侵襲中所發(fā)揮的作用需依賴四跨膜蛋白功能復合體(四跨膜蛋白網絡)，故這些研究制得的單克隆抗體在抑制腫瘤侵襲的同時也嚴重影響了CD151的其他重要功能。本研究合成的多克隆抗體與肝癌細胞和肝癌組織都能較好地結合，且僅針對CD151-整合素α6β1復合體的結合域，故不影響CD151對機體的其他功能。今后，有必要進一步評估本研究合成的多克隆抗體在肝癌侵襲和轉移中的功能。

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