鐘小娟,劉 荷,程金蓮,劉祝祥,陳義光

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,湖南 吉首 416000;2.酒鬼酒股份有限公司,湖南 吉首 416000)

酒鬼酒制曲車間產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌篩選和系統(tǒng)發(fā)育*

鐘小娟1,劉 荷1,程金蓮1,劉祝祥1,陳義光1

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,湖南 吉首 416000;2.酒鬼酒股份有限公司,湖南 吉首 416000)

采用平板水解圈法對(duì)酒鬼酒制曲車間空氣的細(xì)菌進(jìn)行產(chǎn)淀粉酶活性篩選，運(yùn)用基于16S rRNA基因序列的分析法對(duì)高酶活菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析.研究結(jié)果表明，65株受試菌株中，有24.6%的菌株(16株)淀粉水解酶活性呈陽性，其中有4株(JSM 2145008，JSM 2155001，JSM 2155017，JSM 2175012)產(chǎn)淀粉水解酶能力較強(qiáng).基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這4個(gè)菌株分別屬于細(xì)菌域3個(gè)大的系統(tǒng)發(fā)育類群中3個(gè)科的3個(gè)屬.菌株JSM 2145008屬于放線菌門微球菌科，與節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)的氧化節(jié)桿菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切，它們之間的16S rRNA基因序列相似性高達(dá)99.8%，且在系統(tǒng)進(jìn)化樹上形成一個(gè)穩(wěn)定的亞分支；菌株JSM 2155001和JSM 2175012屬于異常球菌——棲熱菌群異常球菌科的異常球菌屬(Deinococcus)，分別與該屬的大瓊異常球菌和云威異常球菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切(序列相似性分別為99.6%和99.9%)；菌株JSM 2155017屬于厚壁菌門芽孢桿菌科，與芽孢桿菌屬(Bacillus)的同溫層芽孢桿菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切(序列相似性為100%)，它們以極高的自展值支持(boostrap value,100%)在系統(tǒng)進(jìn)化樹上聚在一起.上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酒鬼酒制曲車間空氣源細(xì)菌中存在較高比例的產(chǎn)淀粉酶菌株，且這些菌株具有較高的類群多樣性.

酒鬼酒制曲車間；空氣源微生物；淀粉酶活性；系統(tǒng)發(fā)育分析

中國白酒釀造工藝是在相對(duì)開放的環(huán)境中進(jìn)行的，發(fā)酵菌株主要來源于原輔料、空氣、用水、窖泥、窖池、曲藥和糟醅等[1].在釀酒發(fā)酵工藝中，首先需要釀造微生物產(chǎn)生胞外淀粉酶，對(duì)原料中的大宗物質(zhì)淀粉進(jìn)行糖化，這直接影響出酒率，在整個(gè)發(fā)酵過程中起著十分重要的作用.[2]根據(jù)以香味馥郁、酒體凈爽、芳香秀雅、醇厚細(xì)膩的獨(dú)特風(fēng)格著名的酒鬼酒相關(guān)微生物研究報(bào)道可以看出，有學(xué)者對(duì)酒鬼酒小曲、大曲、窖泥等與發(fā)酵工藝直接相關(guān)的微生物以及其獨(dú)特的生產(chǎn)工藝進(jìn)行了一些研究[3]，但對(duì)釀造環(huán)境中相關(guān)微生物的研究暫無報(bào)道.因此，筆者以酒鬼酒制曲車間空氣中的微生物為研究對(duì)象，從中分離篩選出產(chǎn)淀粉酶的細(xì)菌，并對(duì)產(chǎn)淀粉酶菌株的多樣性進(jìn)行研究，以期了解酒鬼酒曲藥空氣源發(fā)酵微生物的基本情況.

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 主要儀器 PCR儀器(PE-9600)購自BIO-RAD公司；PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；其他試劑和儀器同文獻(xiàn)[4].

1.1.2 培養(yǎng)基 (1)營養(yǎng)瓊脂(nutrient agar，NA)：牛肉膏粉3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，加水至1 000 mL，調(diào)整pH值至7.2～7.4；(2)淀粉酶篩選培養(yǎng)基：可溶性淀粉2 g，蛋白胨1 g，酵母膏1 g，瓊脂20 g，加水至1 000 mL，調(diào)整pH值至7.5～8.0.

1.1.3 菌株來源 用于產(chǎn)淀粉酶研究的實(shí)驗(yàn)細(xì)菌菌株共65株，為本實(shí)驗(yàn)室采用空氣沉降法[5]分離自酒鬼酒制曲車間空氣樣品.

1.2淀粉酶活性篩選

實(shí)驗(yàn)菌株用營養(yǎng)瓊脂平板活化后，采用小十字劃線法接種于淀粉酶篩選培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5～7 d.采用平板水解圈法測(cè)定產(chǎn)淀粉酶活性：待實(shí)驗(yàn)菌株形成明顯菌落后，在平板上滴加盧革氏碘液直至鋪滿整個(gè)平板，觀察菌落周圍有無不變色的透明水解圈[6].

1.3系統(tǒng)發(fā)育分析

總DNA提取、16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定方法見文獻(xiàn)[7].根據(jù)測(cè)序結(jié)果，運(yùn)用NCBI網(wǎng)站和EzTaxon server[8]所提供的Blast搜索軟件在GenBank/EMBL/DDBJ等公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行在線相似性序列搜索，選出同源性最高的相關(guān)典型菌株的16S rRNA基因序列并組成序列集；運(yùn)用CLUSTAL X[9]軟件進(jìn)行多重序列比對(duì).根據(jù)Kimura模型[10]估算系統(tǒng)進(jìn)化距離矩陣，采用MEGA 4.0軟件的鄰接法進(jìn)行聚類分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建[11]等系統(tǒng)發(fā)育分析，重復(fù)取樣1 000次，運(yùn)用自展(bootstrap)法來評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[12].

1.4生物學(xué)特性觀察

菌落特征、細(xì)胞形態(tài)和生理生化特性觀察按照常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)[6]所用方法進(jìn)行.

2 結(jié)果與討論

2.1產(chǎn)淀粉酶活性篩選

按照平板水解圈法[5]，對(duì)65株實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行產(chǎn)淀粉酶活性篩選.產(chǎn)淀粉水解酶陽性的菌株共16株，總水解率為24.6%.其中有4株(JSM 2145008，JSM 2155001，JSM 2155017，JSM 2175012)的淀粉水解圈直徑達(dá)30 mm以上(見表1).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酒鬼酒制曲車間空氣中存在較高比例的產(chǎn)淀粉酶菌株，其中部分菌株產(chǎn)淀粉酶活性顯著.

表1 實(shí)驗(yàn)菌株產(chǎn)淀粉酶活性統(tǒng)計(jì)表

2.2基于16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

在產(chǎn)淀粉酶活性較強(qiáng)菌篩選的基礎(chǔ)上，結(jié)合菌落形態(tài)、細(xì)胞顯微形態(tài)及部分生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析，對(duì)4株產(chǎn)淀粉酶活性較強(qiáng)的菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析.分析結(jié)果表明，菌株JSM 2145008屬于放線菌門(Actinobacteria)微球菌科(Micrococcaceae)節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)，與該屬已知種氧化節(jié)桿菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切，與其典型菌株的16S rRNA基因序列相似性高達(dá)99.8%(見表2)，且這2個(gè)菌株在系統(tǒng)進(jìn)化樹上形成一個(gè)穩(wěn)定的亞分支(見圖1)；菌株JSM 2155001和JSM 2175012屬于異常球菌-棲熱菌群異常球菌科異常球菌屬(Deinococcus)，分別與該屬的大瓊異常球菌(Deinococcusdaejeonensis)和云威異常球菌(Deinococcusyunweiensis)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切，序列相似性分別為99.6%和99.9%(見表2)，且在系統(tǒng)進(jìn)化樹上分別形成穩(wěn)定的進(jìn)化分支(見圖1)；菌株JSM 2155017屬于厚壁菌門(Firmicutes)芽孢桿菌科(Bacillaceae)芽孢桿菌屬(Bacillus)，與該屬的同溫層芽孢桿菌(Bacillusstratosphericus)以100%的16S rRNA基因序列相似性和極高的自展值支持(boostrap value,100%)在系統(tǒng)進(jìn)化樹上聚在一起(見圖1和表2).

表2 強(qiáng)產(chǎn)淀粉酶菌株與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最密切的典型菌株間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

圖1 根據(jù)16S rRNA基因序列構(gòu)建的4株產(chǎn)淀粉酶菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3產(chǎn)淀粉酶活性較強(qiáng)菌株的生物學(xué)特征

對(duì)4株產(chǎn)淀粉酶活性較強(qiáng)的菌株進(jìn)行菌落特征、細(xì)胞形態(tài)和部分生理生化特征等生物學(xué)特性的觀察，結(jié)果見表3(所有菌株產(chǎn)物H2S反應(yīng)陰性，并且對(duì)干酪素或纖維水解活性呈陰性反應(yīng)).

表3 產(chǎn)淀粉酶活性較強(qiáng)菌株的部分表型特征

注 +表示陽性；-表示陰性；w表示弱陽性.

3 結(jié)語

采用平板菌落水解圈法對(duì)酒鬼酒制曲車間空氣樣品的細(xì)菌(含放線菌)進(jìn)行產(chǎn)淀粉酶活性篩選，并對(duì)部分陽性較強(qiáng)菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和生物學(xué)特性觀察.研究結(jié)果表明，65株實(shí)驗(yàn)菌株中有16株菌株具有產(chǎn)淀粉酶活性，有4株的淀粉水解圈直徑達(dá)30 mm以上，說明酒鬼酒制曲車間空氣中存在較高比例的產(chǎn)淀粉酶菌株，其中部分菌株產(chǎn)淀粉酶活性顯著.系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，這4個(gè)產(chǎn)淀粉酶活性較強(qiáng)菌株具有較高的類群多樣性，分別屬于3個(gè)大的系統(tǒng)發(fā)育類群(Actinobacteria,Deinococcus-Thermus,Firmicutes)中的3個(gè)科(Bacillaceae,Deinococcaceae,Micrococcaceae)的3個(gè)屬(Arthrobacter,Bacillus,Deinococcus).根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，目前生產(chǎn)應(yīng)用的細(xì)菌源淀粉酶大部分來源于棲熱菌屬(Thermus)[13]、芽孢桿菌屬(Bacillus)[14]和噬纖維菌屬(Cytophaga)[15-16]等，而文中鑒定的產(chǎn)淀粉酶菌株還包括了節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)和異常球菌屬(Deinococcus)，說明在酒鬼酒釀造環(huán)境中存在一些特殊的釀造功能微生物類群，該微生物在酒鬼酒獨(dú)特的馥郁香型和獨(dú)特品質(zhì)的形成方面有何作用，值得進(jìn)一步探討.

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(責(zé)任編輯 陳炳權(quán))

ScreeningandPhylogeneticAnalysisofAmylase-ProducingStrainsIsolatedfromtheAirSamplesfromaLiquorStarter-MakingWorkshopofJiuguiLiquorCo.Ltd.

ZHONG Xiaojuan1,LIU He1,CHENG Jinlian1,LIU Zhuxiang1,CHEN Yiguang1

(1.College of Biology and Environmental Sciences,Jishou University,Jishou 416000,China;2.Jiugui Liquor Co. Ltd.,Jishou 416000,China)

The culturable bacteria in the air samples from a liquor starter-making workshop in Jiugui Liquor Co.Ltd.,China were isolated by using the natural precipitation method and culture-dependent method.The amylase-producing ability of the strains was investigated by using the plate hydrolysis spot method.The results showed that 16 out of 65 (24.6%) strains tested exhibited amylase-producing activity,in which 4 strains (JSM 2145008,JSM 2155001,JSM 2155017,JSM 2175012) could relatively strongly produce amylase.Subsequently,these 4 strains were investigated by means of a phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequence comparisons.The results showed that these 4 strains were the members of 3 families (Bacillaceae,Deinococcaceae,Micrococcaceae) in 3 phylogenetic group/phyla (Actinobacteria,Deinococcus-Thermus,Firmicutes):strain JSM 2145008 belonged to the genus Arthrobacter (Actinobacteria,Micrococcaceae),being most closely to the type strain of Arthrobacter oxydans (sequence similarity 99.8%);strains JSM 2155001 and JSM 2175012 were the members of the genus Deinococcus (Deinococcus-Thermus,Deinococcaceae),being related most closely to the type strains ofDeinococcusdaejeonensis(99.6%) andDeinococcusyunweiensis(99.9%),respectively;strain JSM 2155017 belonged to the genusBacillus(Firmicutes,Bacillaceae),exhibiting 100% 16S rRNA gene sequence similarity to the type strain of Bacillus stratosphericu.In conclusion,there is abundant bacterial diversity,as well as a number of amylase-producing strains in the air samples from a liquor starter-making workshop in Jiugui Liquor Co. Ltd.

liquor starter-making workshop;airborne microbes;amylase activity;phylogenetic analysis

1007-2985(2014)05-0051-04

2014-06-15

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30970007)；湖南省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)資助項(xiàng)目(JSU071312Z01)；湖南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃資助項(xiàng)目(201208Z01)；酒鬼酒股份有限公司委托項(xiàng)目(JGKJ 2012-JD03)；吉首大學(xué)校級(jí)科研課題資助項(xiàng)目(13JDY017)

鐘小娟(1983-)，女(白族)，湖南桑植人，吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院碩士研究生，主要從事微生物資源與生態(tài)研究

陳義光(1965-)，男，湖南新化人，吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事微生物資源與分類研究.

Q939.9；S182

B

10.3969/j.issn.1007-2985.2014.05.012