龐歡瑛,周澤軍,丁 燏,黃郁蔥,吳灶和,簡紀常

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室，廣東 湛江 524088；3.廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制重點實驗室，廣東 湛江 524088；4.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東 廣州 510225)

溶藻弧菌vscO基因在不同環(huán)境下的表達差異*1

龐歡瑛1,2,3,周澤軍1,2,3,丁 燏1,2,3,黃郁蔥1,2,3,吳灶和2,3,4,簡紀常1,2,3

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室，廣東 湛江 524088；3.廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制重點實驗室，廣東 湛江 524088；4.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東 廣州 510225)

為闡明溶藻弧菌vscO的在不同環(huán)境下的表達情況，用半定量RT-PCR方法檢測vscOmRNA在不同生長時期、不同環(huán)境因子(溫度、鹽度和pH值)培養(yǎng)下的相對表達量.結(jié)果表明，溶藻弧菌vscO在對數(shù)期，溫度為28 ℃，鹽度為2%以及培養(yǎng)基起始pH值為7.0時的表達量最高.

溶藻弧菌；Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)；vscO基因；環(huán)境因子；基因表達

溶藻弧菌是一種革蘭氏陰性短桿菌，廣泛存在于水體中，是水生動物弧菌病的主要病原菌之一[1-3]，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失.此外，溶藻弧菌可導(dǎo)致人類的腹瀉、中耳炎以及敗血癥等多種疾病[4-5]，嚴重危害人類健康.許多學(xué)者認為，弧菌屬于海水環(huán)境中的條件致病菌，一般情況下不會引起養(yǎng)殖動物發(fā)生病害[6].但一些環(huán)境因子，例如溫度、鹽度、pH值等均可以調(diào)控其致病性相關(guān)蛋白的表達，從而影響細菌的致病性[7-11].溶藻弧菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system，T3SS)注射裝置，是細菌特有的一種將分泌蛋白注入宿主細胞的超分子復(fù)合物結(jié)構(gòu)，由多種蛋白組成，是致宿主細胞死亡所必須的裝置[12].雖然注射裝置的基因序列已經(jīng)闡明[13]，但是T3SS注射裝置蛋白的激活條件目前仍然不清楚.VscO是T3SS注射裝置針管上的蛋白，其功能主要是協(xié)助分子伴侶將效應(yīng)蛋白護送至胞外，在T3SS致病過程中起重要作用[14].筆者通過半定量RT-PCR方法，檢測不同生長時期、不同環(huán)境因子(溫度、鹽度和pH值)對溶藻弧菌vscO基因表達的影響，以期初步了解vscO基因的表達模式，進而為探討?zhàn)B殖條件的變化對溶藻弧菌致病性的影響奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株 溶藻弧菌HY9901由本實驗室分離并保存[15].

1.1.2 主要試劑 ExTaq DNA聚合酶、dNTP和DL 2000Marker均購自TaKaRa公司；RNA提取試劑盒購自上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司，其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純；RT-PCR 引物合成由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成.

1.2方法

1.2.1 溶藻弧菌在不同生長時期的培養(yǎng) 根據(jù)前期研究的結(jié)果[16]，當(dāng)培養(yǎng)時間為2，5，12，24 h時，分別對應(yīng)著溶藻弧菌的遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期.因此，將溶藻弧菌在28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h后，按0.2%的比例轉(zhuǎn)接于TSB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在2，5，12，24 h時，取1 mL菌液，離心收集菌體備用.1.2.2 溶藻弧菌不同溫度下的培養(yǎng) 將溶藻弧菌于28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h后，按0.2%的比例轉(zhuǎn)接于TSB(初始 pH值為7.0，鹽度為2%)培養(yǎng)基中，分別置于不同溫度(20，25，28，30，37 ℃)，200 r/min振蕩培養(yǎng)5 h，取1 mL菌液離心收集菌體備用.

1.2.3 溶藻弧菌不同鹽度下的培養(yǎng) 將溶藻弧菌于28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h后，按0.2%的比例分別轉(zhuǎn)接于鹽度為0.8%，2%，5%，8%，10%的TSB(初始 pH值為7.0)中，28 ℃，200 r/min培養(yǎng)5 h，取1 mL菌液離心收集菌體備用.

1.2.4 溶藻弧菌在不同初始pH值下的培養(yǎng) 將溶藻弧菌于28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h后，按0.2%的比例分別轉(zhuǎn)接于初始pH值為5.0，7.0，9.0，12.0的TSB(鹽度為2%)中，28 ℃，200 r/min培養(yǎng)5 h，取1 mL菌液離心收集菌體備用.

1.2.5 總RNA的提取 分別加入1 mL 的Trizol試劑于1.2.1—1.2.4節(jié)收集的菌體內(nèi)，混合均勻，靜置7 min，加入0.2 mL 氯仿(chloroform)，振蕩15 s，靜置3 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min；取上清移入一干凈的EP管，加入異丙醇(isopropanol)500 μL，靜置15 min，4 ℃，11 800 r/min離心10～20 min；75%乙醇洗滌沉淀；離心并晾干后加入48 μL無RNase DEPC水溶解RNA，取3 μL電泳檢測后-80 ℃超低溫保存?zhèn)溆?

1.2.6 DNase I消化和cDNA的制備 在進行RT-PCR研究，有基因組DNA污染提取的RNA時，會嚴重影響逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)品成分，使得RT-PCR分析時使用的模版不準確，導(dǎo)致研究結(jié)果出現(xiàn)錯誤.所以，在進行模板鏈合成之前，需要用DNase I消化清除總RNA的DNA污染.cDNA制備參考逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序為：25 ℃，30 min；37 ℃，10 min；90 ℃，3 min.-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.7 RT-PCR引物設(shè)計 根據(jù)溶藻弧菌vscO基因(Genbank No.：JX131326)的保守序列設(shè)計特異性引物進行RT-PCR分析(見表1)，選取16S rRNA基因作為對照基因(Genbank No.:NR_044825).

表1 RT-PCR分析中使用的引物

1.2.8 半定量RT-PCR平臺期的確定 當(dāng)RT-PCR擴增處于對數(shù)期時，模板量與擴增產(chǎn)物成正比.當(dāng)RT-PCR擴增進入后期時，因DNA聚合酶活性的下降以及溶液中反應(yīng)底物的耗盡，擴增產(chǎn)物將達到一個平臺期，之后擴增產(chǎn)物不會隨模板量增加而增加.為使擴增產(chǎn)物處在平臺期前的線性增長范圍內(nèi)，并在瓊脂糖凝膠上可進行定量分析，需要確定到達平臺期的循環(huán)數(shù).方法為：以TSB(初始 pH值為7.0，鹽度為2%)中28 ℃培養(yǎng)5 h的溶藻弧菌cDNA一鏈作為模板，稀釋10倍后分別用vscO引物和16S rRNA引物進行不同循環(huán)數(shù)的PCR擴增,PCR程序為94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)次數(shù)依次為23，28，30，33，36，72 ℃ 10 min，1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物.用AlphaImager HP軟件掃描各個電泳條帶的光密度曲線積分面積(Intergrated Optical Density，IOD)，然后進行定量分析.以PCR產(chǎn)物的IOD為縱坐標，相應(yīng)循環(huán)數(shù)為橫坐標作圖，分析確定最佳循環(huán)數(shù).

1.2.9 不同生長階段和不同環(huán)境條件下vscOmRNA的相對表達量 以1.2.5節(jié)提取的各個樣品cDNA一鏈稀釋10倍為模板，分別以vscO基因引物和16S rRNA基因引物進行PCR擴增，反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min.反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析.用AlphaImager HP軟件掃描各個電泳條帶的IOD，以vscO基因和16S rRNA基因的光密度值之比作為vscO基因的相對表達量，分析vscO基因在不同生長階段和不同環(huán)境下的表達差異.應(yīng)用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析.**表示與同期對照組相比差異極顯著(P<0.01)，*表示與同期對照組相比差異顯著(P<0.05).

2 結(jié)果

2.1半定量RTPCR平臺期的確定

圖1 vscO和16S rRNA不同循環(huán)數(shù)的PCR結(jié)果

分析vscO基因和16S rRNA的不同循環(huán)數(shù)的IOD發(fā)現(xiàn)，vscO基因和16S rRNA在30個循環(huán)之前為對數(shù)期，之后進入到平臺期，因此選擇30個循環(huán)作為RT-PCR的最佳循環(huán)數(shù)(見圖1).

2.2不同生長階段vscO基因的表達

由圖2可知，在不同生長時期，vscO基因的表達差異很大.在遲緩期，vscO很少合成或不合成；而在對數(shù)期，vscO的相對表達量最高，達到4.2左右；在穩(wěn)定期和衰亡期，vscO表達量均維持在2.5以上.因此，選擇對數(shù)期(培養(yǎng)5 h)作為在其他環(huán)境條件下的培養(yǎng)時間.

圖2 vscO mRNA在不同生長階段的表達

2.3不同環(huán)境因子下vscO基因的表達

在不同環(huán)境因子下，vscO的表達也呈現(xiàn)很大差異.由圖3—5可知，在溫度為28 ℃、鹽度為2%以及培養(yǎng)基起始pH值為7.0時，vscO的相對表達量最高.而在其他條件下，vscO的表達量則很低.

圖3 vscO mRNA在不同溫度下的表達

圖4 vscO mRNA在不同鹽度下的表達

圖5 vscO mRNA在不同pH值下的表達

3 討論

相關(guān)研究表明，病原性溶藻弧菌的堿性絲氨酸蛋白酶和胞外多聚糖等致病因子受群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控，在遲緩期和對數(shù)期合成量很少，在穩(wěn)定期和衰亡期才大量合成[17-19].但在本研究中，vscO基因在對數(shù)期就開始大量表達，提示vscO的表達也可能受到細菌密度感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控而發(fā)揮作用.

溫度作為環(huán)境因子中的重要因素之一，與細菌的致病性密切相關(guān).溶藻弧菌為嗜溫菌，隨著溫度的降低其數(shù)量也明顯減少[10]，因此它引發(fā)的水產(chǎn)動物弧菌病多發(fā)生在夏季，水溫25～32 ℃[20].之前的研究[21]也發(fā)現(xiàn)，在28 ℃培養(yǎng)時，溶藻弧菌胞外產(chǎn)物的酶活性及其對紅笛鯛的致死率均為最大.本實驗中，溶藻弧菌的vscO基因在28 ℃培養(yǎng)下，其mRNA表達量最高.由此可見,vscO的表達調(diào)控可能與溶藻弧菌在28 ℃時的致病能力最強存在一定關(guān)系.

溶藻弧菌是一種嗜鹽菌，生長鹽度范圍2%～8%，最佳鹽度2%～3%.溶藻弧菌適合生長在堿性環(huán)境中，生長pH值范圍6.0～9.0.當(dāng)鹽度2%，起始pH值7.0時，vscO基因的表達量也最高，說明溶藻弧菌vscO在最適生長條件下的表達量與其致病性可能存在一定關(guān)系.

4 結(jié)語

以致病性溶藻弧菌作為研究對象，研究了不同生長階段以及不同環(huán)境因子對T3SS注射裝置蛋白VscO mRNA表達量的影響，發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌vscOmRNA在對數(shù)期，溫度28 ℃，鹽度2%，起始pH值7.0時的表達量最高.實驗結(jié)果為今后進一步探討溶藻弧菌T3SS的致病機理與養(yǎng)殖環(huán)境的關(guān)系奠定了基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯 易必武)

DifferentExpressionsofvscOGenefromVibrioAlginolyticusinDifferentEnvironments

PANG Huanying1,2,3,ZHOU Zejun1,2,3,DING Yu1,2,3,HUANG Yucong1,2,3,WU Zaohe2,3,4,JIAN Jichang1,2,3

(1.Fisheries College of Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,Guangdong China;2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals,Zhanjiang 524088,Guangdong China;3.Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals,Guangdong Higher Education Institutions,Zhanjiang 524088,Guangdong China;4.Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China)

To understand the impact of environmental factors on the expressions ofvscOgene,the mRNA expressions ofvscOgene in different growth periods and with environmental factors,such as temperature,salinity and pH,were detected by RT-PCR method. The results indicated that the mRNA expression ofvscOreached a maximum at 28 ℃ in salinity of 2%,with the initial medium pH 7.0 whenV.alginolyticuswas in the middle phase of growth.

Vibrioalginolyticus;T3SS;vscOgene;environmental factors;gene expression

1007-2985(2014)04-0059-05

2014-05-14

國家科技支撐計劃項目(2012BAD17B02,2012BAD17B03)；廣東省自然科學(xué)基金資助項目(S2013040014562)

龐歡瑛(1980-)，女，廣西北海人，廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院講師，博士，主要從事水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害研究

簡紀常(1964-)，男，廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院教授，博士，主要從事水產(chǎn)經(jīng)濟動物免疫學(xué)及病害控制研究，E mail jianjc@gmail.com；丁 燏(1971-)，男，廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院教授，博士，主要從事水產(chǎn)經(jīng)濟動物免疫學(xué)及病害控制研究，E mail dingy@gdou.edu.cn.

Q935

B

10.3969/j.issn.1007-2985.2014.04.014