宋忠魁，潘文秀，謝濤，葉開(kāi)富，龍智翔，黃島平

（1.廣西分析測(cè)試研究中心，廣西南寧 530022；2.廣西海洋研究所，廣西北海 536000；3.欽州學(xué)院數(shù)學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)學(xué)院，廣西欽州 535099）

廣西近江牡蠣中性蛋白酶酶解工藝優(yōu)化

宋忠魁1，2，潘文秀3，謝濤1，葉開(kāi)富1，龍智翔1，黃島平1

（1.廣西分析測(cè)試研究中心，廣西南寧 530022；2.廣西海洋研究所，廣西北海 536000；3.欽州學(xué)院數(shù)學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)學(xué)院，廣西欽州 535099）

優(yōu)化影響近江牡蠣中性蛋白酶酶解的幾個(gè)關(guān)鍵因素，包括溫度、pH、加酶量和時(shí)間。通過(guò)建立L16（44）正交表，并以水解度和鮮味氨基酸百分比為試驗(yàn)指標(biāo)開(kāi)展優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。其中以水解度為試驗(yàn)指標(biāo)時(shí)，工藝優(yōu)水平是酶解溫度45℃、pH7.5、加酶量3 900 U/g、酶解時(shí)間5 h；以鮮味氨基酸百分比為試驗(yàn)指標(biāo)時(shí)，工藝優(yōu)水平是酶解溫度40℃、pH7.5、加酶量3 900 U/g、酶解時(shí)間4 h。溫度是影響中性蛋白酶酶解工藝的首要因素。

關(guān)鍵詞：近江牡蠣；中性蛋白酶；鮮味氨基酸

應(yīng)用生物酶法改變傳統(tǒng)蠔油生產(chǎn)工藝的相關(guān)研究由來(lái)已久，包括了酶種的篩選與評(píng)價(jià)、從單酶種酶解到多酶種的復(fù)合酶解、從單因素試驗(yàn)到正交試驗(yàn)方法的應(yīng)用等[1-8]。研究獲得了一系列酶種水解牡蠣反應(yīng)的優(yōu)水平，如果從生產(chǎn)蠔油的目的出發(fā)，多數(shù)研究推薦使用中性蛋白酶，因?yàn)槠涔ぷ鞯乃釅A度環(huán)境與新鮮牡蠣肉的pH接近[1]，并且水解度適中、水解產(chǎn)物的風(fēng)味好[2-4]。從已報(bào)道的中性蛋白酶酶解牡蠣的優(yōu)水平來(lái)看，決定酶解反應(yīng)的幾個(gè)要素是有波動(dòng)的，不同的牡蠣種類(lèi)、同一牡蠣種類(lèi)但不同來(lái)源以及不同的試驗(yàn)指標(biāo)對(duì)之均有影響。

廣西沿海盛產(chǎn)近江牡蠣[9]，為酶法生產(chǎn)蠔油提供了大量的原材料。文章采用水解度和鮮味氨基酸百分比作為試驗(yàn)指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)探討枯草芽孢桿菌中性蛋白酶酶解近江牡蠣的工藝條件，基于極差分析和方差分析提出工藝優(yōu)水平，為開(kāi)展近江牡蠣酶法生產(chǎn)蠔油中試提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

近江牡蠣鮮品由廣西欽州市海華蠔業(yè)科技有限公司提供，去殼取牡蠣肉，直接使用Milli-Q水清洗，塑料網(wǎng)篩瀝水，組織搗碎、分裝、冷凍貯藏。

枯草芽孢桿菌中性蛋白酶（13萬(wàn)U/g）購(gòu)自南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli－Q Academic A10 超純水機(jī)：美國(guó) MILLIPORE公司；LB20ES高速組織搗碎機(jī)：美國(guó)WARING公司；HJ－3控溫磁力攪拌器：江蘇金壇醫(yī)療儀器廠；PHSJ－4A pH酸度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHHW21.600A三用恒溫水箱：上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；簡(jiǎn)易凱氏定氮裝置：南寧匯鑫化玻儀器有限公司；CL31R臺(tái)式多用離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

近江牡蠣去殼、洗凈、瀝干→稱(chēng)重、搗碎→調(diào)pH、加酶→保溫酶解→酶滅活→離心→殘?jiān)Q(chēng)重。

1.3.2 總氨基氮質(zhì)量測(cè)定

采用甲醛滴定法[10]測(cè)定水解液的總氨基氮質(zhì)量。

1.3.3 總氮質(zhì)量的測(cè)定

依據(jù)《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定方法》（GB5009.5－85），采用凱氏定氮法測(cè)定水解液的總氮含量。

1.3.4 氨基酸質(zhì)量的測(cè)定

委托廣西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心檢測(cè)（檢驗(yàn)報(bào)告編號(hào)：LL1004060E；樣品編號(hào)：LL1004060E－379～394）。

1.4 計(jì)算公式

1.4.1 水解度計(jì)算

1.4.2 鮮味氨基酸質(zhì)量百分比計(jì)算

[11－13]，規(guī)定這里的鮮味氨基酸包括天門(mén)冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸等。

1.5 工藝優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用四因素、四水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行工藝優(yōu)化，因素、水平設(shè)置如表1所示。

表1 因素、水平排列表Table 1 Arrangements of the levels and the factors

2 結(jié)果與分析

2.1 近江牡蠣酶解的正交試驗(yàn)

酶解試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

其中k1～k4是ABCD 4個(gè)因素在4個(gè)水平的水解度之和，k1～k4是ABCD 4個(gè)因素在4個(gè)水平的鮮味氨基酸百分比之和；極差（R或R）是ABCD 4個(gè)因素在4個(gè)水平上最大的綜合平均值與最小的綜合平均值之差。從水解度的K值看，工藝優(yōu)水平是A2B3C3D4；從鮮味氨基酸百分比之K值看，工藝優(yōu)水平是A1B3C3D3。極差分析表明，以水解度為試驗(yàn)指標(biāo)，主次因素是A＞C＞D＞B；以鮮味氨基酸百分比為試驗(yàn)指標(biāo)，主次因素是A＞D＞C＞B。

表2 近江牡蠣酶解的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results from Orthogonal arrays of Ostrea rivularis enzymolysis

圖1 同種處理水解度和鮮味氨基酸百分比的對(duì)照Fig.1 Pairwise comparison between degree hydrolysis（DH）and the percentage of delicious amino acid under the same treatment

圖1能直觀地反映水解度、鮮味氨基酸百分比兩者之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，兩者之間表現(xiàn)出的一致性比較差，即水解度高并不意味鮮味氨基酸百分比高。由此表明：近江牡蠣酶解試驗(yàn)過(guò)程是復(fù)雜的，選擇不同的酶解試驗(yàn)指標(biāo)需要制定不同的優(yōu)化方案。

2.2 單因素方差分析

利用PASW Statistics 18開(kāi)展單因素方差分析，結(jié)果表明：以水解度為指標(biāo)，4個(gè)因素均未表現(xiàn)出方差顯著性（P值均大于0.05，表3）；以鮮味氨基酸百分比為指標(biāo)，4個(gè)因素的P值均大于0.05（表4）；同時(shí)，無(wú)論以水解度還是以鮮味氨基酸百分比為指標(biāo)，單因素方差分析揭示的ABCD 4個(gè)因素的主次順序均是A＞D＞C＞B。由此看來(lái)，以水解度為試驗(yàn)指標(biāo)時(shí)，單因素方差分析與極差分析所產(chǎn)出的結(jié)果有出入；以鮮味氨基酸百分比為試驗(yàn)指標(biāo)時(shí)，單因素方差分析與極差分析的結(jié)果保持一致。

表3 水解度的單因素方差分析Table 3 One-way ANOVA（Analysis of Variance）of degree hydrolysis（DH）

表4 鮮味氨基酸百分比的單因素方差分析Table 4 One-way ANOVA based on the percentage of delicious amino acid（DAA）

假定方差齊性并執(zhí)行LSD（L）測(cè)試以開(kāi)展單個(gè)因素水平間兩兩比較，結(jié)果表明：以水解度為指標(biāo)，因素A（溫度）的水平1和水平4、水平2和水平4之間的差異接近顯著性（P1，4=0.086，P2，4=0.071），其余水平之間未檢測(cè)到顯著性，BCD 3個(gè)因素的不同水平之間的比較均未檢測(cè)到顯著性；以鮮味氨基酸百分比為指標(biāo)，僅在因素A（溫度）的水平1和水平3之間檢測(cè)到顯著性（P1，3=0.031）。

3結(jié)論

酶解工藝需要優(yōu)化的因素通常包括pH、溫度、加酶量、時(shí)間和底物濃度，這里采用的是固定的料水比（1∶3），也就是一定的底物濃度；所以，選擇其余4個(gè)因素作為優(yōu)化對(duì)象并利用L16（44）正交表優(yōu)化之，結(jié)論如下：

1）選擇水解度為試驗(yàn)指標(biāo)時(shí)，工藝優(yōu)水平是A2B3C3D4，即酶解溫度（45℃）、加酶量（3 900 U/g）、pH7.5、酶解時(shí)間（5h）；選擇鮮味氨基酸百分比為試驗(yàn)指標(biāo)時(shí)，工藝優(yōu)水平是A1B3C3D3，即酶解溫度（40℃）、加酶量（3900U/g）、pH 值 7.5、酶解時(shí)間（4 h）；其中，加酶量（3 900 U/g）和pH（7.5）被一致選擇。

2）在4個(gè)因素中，溫度是影響中性酶酶解工藝的首要因素，而時(shí)間因素是相對(duì)次要的因素；極差分析和方差分析結(jié)果基本保持一致。至于因素的主次關(guān)系可能與因素的設(shè)置水平有關(guān)，譬如，熊輝巖和段瑞君的研究結(jié)果指出pH是影響中性酶酶解的首要因素[14]。

3）在同樣處理下，水解度和鮮味氨基酸百分比之間的關(guān)系是水解度高并不意味鮮味氨基酸百分比高。由此表明，同一酶種若采用不同試驗(yàn)指標(biāo)，工藝參數(shù)需要優(yōu)化。此外，同一酶種因研究目標(biāo)不同其工藝參數(shù)變化也很大，汪秋寬等[15]利用中性蛋白酶酶解牡蠣以制備抗氧化活性肽的最佳酶解工藝參數(shù)竟然是酶解時(shí)間110 min、酶用量3%、溫度 65℃、pH 6.0，與以生產(chǎn)蠔油為目標(biāo)的參數(shù)比較有較大出入，尤其是溫度和pH。

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[1]吳永沛.酶法加工牡蠣調(diào)味品的研究[J].廈門(mén)水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),1989(1):52－58

[2]閆亞梅,盧長(zhǎng)潤(rùn).酶法水解牡蠣肉及其制品的研究[J].中國(guó)調(diào)味品,1995(5):5－7

[3]滕瑜,喬向英,曲克明.牡蠣酶解工藝條件的研究[J].海洋水產(chǎn)研究,1997,18(1):112－116

[4]鄧尚貴,章超樺,李蘋(píng)蘋(píng),等.酶法制造出口蠔汁的加工工藝[J].食品科技,1999(3):24－25

[5]王亮,張慜,杜衛(wèi)華,等.牡蠣肉雙酶復(fù)合水解工藝[J].無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào),2003,22(3):97－100

[6]汪何雅,楊瑞金,王璋.牡蠣的營(yíng)養(yǎng)成分及蛋白質(zhì)的酶法水解[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2003,27(2):163－168

[7]付猛,云霞,朱蓓薇.牡蠣雙酶水解工藝的研究[J].食品科學(xué),2004,25(7):100－104

[8]吳文龍,楊志娟.雙酶法水解牡蠣肉工藝條件的研究[J].食品科技,2005(11):32－34

[9]龐耀珊,謝芝勛,謝麗基,等.廣西牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的現(xiàn)狀與發(fā)展對(duì)策[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,43(12):2118－2121

[10]陳鈞輝．生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]．北京:科學(xué)出版社,2003:57－58

[11]楊志娟.牡蠣鮮味油的研制[J].食品科技,2003(2):34－35,49

[12]王小紅,錢(qián)驊,張衛(wèi)明,等.食用菌呈味物質(zhì)研究進(jìn)展[J].中國(guó)野生植物資源,2009,28(1):5－8

[13]黃高凌,王衍慶.花蛤凈化前后主要營(yíng)養(yǎng)成分及鮮味氨基酸的比較[J].食品科學(xué),2006,27(10):477－480

[14]熊輝巖,段瑞君.蠔油酶水解條件的研究[J].青海大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,1999,17(3):26－29

[15]汪秋寬,宋琳琳,徐玲,等.牡蠣抗氧化活性肽的酶解工藝研究[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,24(2):95－99

Hydrolysis Technology Optimization of Neutral Proteinase for Guangxi Ostrea Rivularis

SONG Zhong-kui1，2，PAN Wen-xiu3，XIE Tao1，YE Kai-fu1，LONG Zhi-xiang1，HUANG Dao-ping1
（1.Guangxi Zhuang Autonomous Region Center for Analysis&Test Research Nanning 530022，Guangxi，China；2.Guangxi Institute of Oceanology，Beihai 536000，Guangxi，China；3.College of Mathematics&Computer Science，Qinzhou University，Qinzhou 535000，Guangxi，China）

Abstract：To optimize the four key factors including temperature， pH value， protease volume， and time for neutral proteinase hydrolyzing fresh oyster，the L16（44）orthogonal list was first chosen in the test，and then hydrolysis degree and percentage of delicious amino acid as array criteria.The optimal technology parameters for the hydrolysis degree were temperature 45℃，pH value 7.5，protease volume 3 900 U/g，and hydrolysis time 5 h，while using the percentage of delicious amino acid，instead of temperature 40℃，pH value 7.5，protease volume 3 900 U/g，and hydrolysis time 4 h.The results showed that the temperature was corroborated as the most important factor of enzymatic technology of neutral proteinase.

Key words：Ostrea rivularis；neutral proteinase；delicious amino acid

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.016

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科攻09321004)

宋忠魁（1973—），男（漢），副教授，博士，研究方向：水產(chǎn)、食品生物技術(shù)。

2013－12－29