李敏，周均，謝勝利

（1.長江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶 408100；2.長江師范學(xué)院數(shù)學(xué)與計算機學(xué)院，重慶 408100）

莖瘤芥皮筋葉綠素提取工藝優(yōu)化

李敏1，周均2，*，謝勝利1

（1.長江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶 408100；2.長江師范學(xué)院數(shù)學(xué)與計算機學(xué)院，重慶 408100）

摘 要：采用莖瘤芥皮筋為試驗材料，采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗優(yōu)化超聲波輔助提取莖瘤芥皮筋中葉綠素，通過試驗得出乙醇體積分數(shù)、料液比和超聲時間與莖瘤芥皮筋葉綠素提取率的回歸方程，該二次回歸方程模型的F檢驗達到了極顯著水平，可用于對模型的預(yù)測。通過回歸方程得出莖瘤芥皮筋葉綠素提取優(yōu)化工藝條件為乙醇體積分數(shù)為30%，料液比為1∶2，超聲提取時間為80 min。該項研究可為榨菜的深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：莖瘤；葉綠素；超聲波；提取工藝

莖瘤芥（var.tumidaTsen et Lee）屬十字花科芥屬芥菜種的一個變種。榨菜加工僅用莖瘤芥的瘤狀莖（可食用部分）作原料，而數(shù)量巨大的莖瘤芥非可食部分，如葉、皮和筋約占收獲量的50%，其中皮筋占瘤莖重量的百分比為3%，長期作為廢物棄于田間、路邊，污染環(huán)境，腐敗物進入水體，污染水質(zhì)，引起富營養(yǎng)化，嚴重威脅生態(tài)環(huán)境，并造成資源浪費。

莖瘤芥皮筋中含有多種有效成分如纖維素、果膠和一定含量的葉綠素，如果有效利用可變廢為寶，其中葉綠素及其衍生物葉綠素銅鈉鹽、葉綠素鋅鈉鹽是極具開發(fā)潛力的天然綠色素，其性質(zhì)穩(wěn)定，著色良好，主要用于食品著色，廣泛用于果味水、果味粉、果子露、汽水、配制酒、糖果、罐頭等食品的著色；葉綠素還具有除臭、抑菌的作用，因此廣泛用于牙膏、化妝品等日用化工行業(yè)；葉綠素還具有改善便秘、降低膽固醇、抗衰老、排毒消炎、抗癌、抗突變、在臨床上葉綠素a可防止傷口感染，具有收斂傷口、促進愈合等功效，因此廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，由葉綠素制成的銅鈉鹽可作為30多種藥物的添加成分，用于治療傳染性肝炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、慢性腎炎、急性胰腺炎、痔瘡、灼傷及燙傷等疾病，手術(shù)后服用葉綠素可以減少抗生素的用量；最近，日本的一項研究表明，葉綠素有助于消除體內(nèi)累積的二惡英[1-5]。

我國天然食用色素研究較晚，葉綠素的提取主要采用有機溶劑直接浸提、微波提取、超聲波提取及超臨界萃取等方法，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)主要采用蠶沙提取葉綠素采用的是有機溶劑直接提取法，從蠶沙中提取葉綠素受季節(jié)和原材料的影響，有關(guān)姜葉、竹葉、鳳眼蓮、青草、茶葉、蔬菜、螺旋藻等植物中提取葉綠素的研究也有報道[6-12]，但是未見產(chǎn)業(yè)化報道。葉綠素產(chǎn)業(yè)化提取主要采用有機溶劑直接提取法，該種方法需要儀器設(shè)備少，成本低，但是提取效率欠高，葉綠素純度、質(zhì)量有待提高，采用超聲波技術(shù)和微波萃取技術(shù)可以有效提高葉綠素的得率、產(chǎn)量，超臨界萃取技術(shù)由于設(shè)備要求高，成本高，還難以在生產(chǎn)上得到有效利用。當前對莖瘤芥葉提取葉綠素已有研究，李敏等研究了莖瘤芥葉葉綠素的穩(wěn)定性，采用有機溶劑和果膠酶輔助提取莖瘤芥葉綠素具有較好的效果[13-14]，但對于莖瘤芥皮筋提取葉綠素還未見相關(guān)報道。因而本項目研究將推動榨菜生產(chǎn)廢棄物再利用，可使農(nóng)民增收，并帶動傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)升級；同時，使生物質(zhì)資源得到了最大限度的利用，變廢為寶，促進保護環(huán)境。為延長榨菜產(chǎn)業(yè)鏈，為榨菜的深度開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑與儀器

1.1.1 實驗材料

莖瘤芥，取自涪陵區(qū)李渡街道辦事處。

1.1.2 主要試劑、儀器

1.1.2.1 主要試劑

丙酮、無水乙醇、氫氧化鈉、石油醚、鹽酸、硫酸銅均為分析純。

1.1.2.2 儀器

HR2024菲利浦攪拌機：菲利浦電器有限公司；便攜式pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；EL204電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-4水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；LDZ5-2低速自動平衡離心機：北京京立離心機有限公司；U-3010紫外可見分光光度計：日本日立有限公司；SB3200超聲波清洗器：上海靈波新芝有限公司。

1.2 工藝流程

莖瘤芥→剝皮→將皮筋切成顆粒后，搗成勻漿→加入有機溶劑超聲波輔助浸提→離心分離→測葉綠素含量

1.3 葉綠素含量的測定

準確吸取1 mL葉綠素提取液，稀釋至100 mL，分別測定其在663 nm和645 nm的吸光度，葉綠素含量計算公式如下：

式中：A663、A645分別為葉綠素提取液在663 nm和645 nm處的吸光度；v為提取液的體積，L；n為稀釋倍數(shù)；m為莖瘤芥葉勻漿質(zhì)量，g。

1.4 試驗設(shè)計

1.4.1 浸提劑的選擇

準確稱取20 g莖瘤芥皮筋勻漿，分別加入無水乙醇，無水丙酮，乙醇/丙酮（體積比 1∶1），丙酮/水（1∶1）40 mL，料液比 1∶2（g/mL），在超聲波功率 400 W 下超聲波提取80 min，離心，在645，663 nm處測吸光度，測定葉綠素的含量。每個處理設(shè)三個重復(fù)。

1.4.2 料液比對葉綠素提取率的影響

準確稱取20 g莖瘤芥皮筋勻漿，按照不同的料液比，1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（g/mL）的比例加入乙醇/丙酮混合液，在超聲波功率400 W下超聲波提取80 min，離心，在645，663 nm處測吸光度，測葉綠素的含量，每個處理設(shè)3次重復(fù)。

1.4.3 乙醇濃度對葉綠素提取率的影響

準確稱取20g莖瘤芥皮筋勻漿，料液比1∶2（g/mL），在超聲波功率400 W下分別加入乙醇體積分數(shù)20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%的乙醇/丙酮混合液40 mL，在超聲波功率400 W下超聲波提取80 min，離心，在645，663 nm處測吸光度，測定葉綠素含量。每個處理設(shè)3個重復(fù)。

1.4.4 浸提時間的選擇

準確稱取20 g莖瘤芥皮筋勻漿，分別加入乙醇/丙酮 40 mL，料液比 1∶2（g/mL），在超聲波功率 400 W下分別提取 20、40、60、80、100、120、140 min，然后離心，測定葉綠素的含量。每個處理設(shè)3個重復(fù)。

1.4.5 葉綠素提取的優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗優(yōu)化莖瘤芥皮筋葉綠素提取工藝，以乙醇體積分數(shù)、料液比和超聲提取時間為考察因素，設(shè)計三因素五水平二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗。因素水平如表1所示。

表1 因素水平編碼表Table 1 Code table of factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 浸提劑對葉綠素提取率的影響

浸提劑對葉綠素提取率的影響見圖1。

圖1 不同浸提劑對葉綠素提取率的影響Fig.1 Effect of different extactant on the extraction ratio of chlorophyll from Tumorous Stem Mustard skin

從圖1可以看出，浸提劑不同葉綠素提取率差異較大，葉綠素提取率最大的是乙醇和丙酮按1∶1混溶的浸提劑，葉綠素提取率最小的是丙酮和水的浸提劑，為此在以后的實驗中選擇乙醇∶丙酮（1∶1）的溶劑作為浸提劑。

2.2 料液比對葉綠素提取率的影響

料液比對葉綠素提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對葉綠素提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction ratio of chlorophyll from Tumorous Stem Mustard skin

由圖2可知，料液比1∶2（g/mL）時，葉綠素的提取達到最高；料液比1∶2（g/mL）后逐漸趨于平衡，略有下降。

2.3 乙醇濃度對葉綠素提取率的影響

乙醇濃度對葉綠素提取率的影響見圖3。

從圖3可知，隨著乙醇濃度的增加，葉綠素提取率增加，當乙醇濃度達到30%時，葉綠素提取率達到最高，隨后隨著乙醇濃度增加，葉綠素提取率下降。

2.4 超聲時間對葉綠素提取率的影響

超聲時間對葉綠素提取率的影響見圖4。

圖3 乙醇濃度對葉綠素提取率的影響Fig.3 Effect of alcohol concetration on the extraction ratio of chlorophyll from Tumorous Stem Mustard skin

圖4 超聲時間對葉綠素提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction ratio of chlorophyll from Tumorous Stem Mustard skin

從圖4可知，隨著超聲時間的增加，葉綠素提取率增加，80 min時，葉綠素提取率達到最大，隨后隨著超聲時間的增加，葉綠素提取率下降。

2.5 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗結(jié)果

2.5.1 回歸方程的建立與檢驗

二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗驗結(jié)果見表2。

表2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of quadratic regression rotationorthogonal combination test

對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，二次回歸方程的模型的F檢驗達到了極顯著水平（P<0.01），說明模型預(yù)測值與實際值擬合度度，可用于對模型的預(yù)測。但是回歸方程的失擬項F檢驗（P<0.01）達到極顯著水平，說明存在失擬因子對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響。通過對回歸系數(shù)的顯著性檢驗可知，影響莖瘤芥皮筋葉綠素提取率的因素中，料液比對葉綠素的影響達到了極顯著水平，超聲時間和乙醇濃度對葉綠素的提取未達顯著水平。

對回歸系數(shù)進行顯著性檢驗，在α=0.1顯著水平剔除不顯著項，得到優(yōu)化后的方程如下：

Y=3.790 58+0.708 46x2-0.250 29x12-0.888 1x22

2.5.2 莖瘤芥皮筋葉綠素提取優(yōu)化驗證

通過回歸方程得出莖瘤芥皮筋葉綠素提取優(yōu)化工藝條件為x1=0，x2=0，x3=-1.682，即乙醇體積分數(shù)為30%，料液比為 1∶2（g/mL），超聲提取時間為 80 min，莖瘤芥皮筋葉綠素提取率為3.79%。在試驗中有此條件，其實際值為4.014%，與理論值接近。

3 結(jié)論

采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗優(yōu)化超聲波輔助提取莖瘤芥皮筋葉綠素，通過試驗得出乙醇體積分數(shù)、料液比和超聲時間與莖瘤芥皮筋葉綠素提取率的回歸方程，該二次回歸方程的模型的F檢驗達到了極顯著水平，可用于對模型的預(yù)測。通過回歸方程得出莖瘤芥皮筋葉綠素提取優(yōu)化工藝條件為乙醇體積分數(shù)為30%，料液比為1∶2（g/mL），超聲提取時間為80 min。

：

[1]劉峰.植物抗誘變活性測定[J].醫(yī)學(xué)動物防治,2004,20(11):657-658

[2]柳新平,王新明,周開文,等.葉綠素在腫瘤防治中的應(yīng)用研究進展[J].中國腫瘤臨床與康復(fù),2007,14(3):269-271

[3]黃持都,胡小松,廖小軍,等.葉綠素研究進展[J].中國食品添加劑,2007(3):114-118

[4]鄭國棟,歐陽文,顏苗,等.葉綠素及其衍生物的藥理研究進展[J].中南藥學(xué),2006,4(2):146-148

[5]李月,樊軍文,陳志龍.葉綠素衍生物的生物活性研究進展[J].藥學(xué)實踐雜志,2001,19(5):266-269

[6]嚴桂芹,章世元,王俊,等.蠶沙葉綠素的提取及分析測定[J].林業(yè)科技,2008,33(4):60-62

[7]羅祖友,袁萍,莫開菊.姜葉葉綠素的提取及葉綠素銅鈉的制備[J].食品科學(xué),2008,29(10):361-364

[8]陽東青.從竹葉中提取葉綠素[J].牙膏工業(yè),2008(3):36-38

[9]吳榮金,林澤浩,陳鍵.鳳眼蓮葉葉綠素的提取及其性質(zhì)的穩(wěn)定性[J].儀器儀表與分析監(jiān)測,2007(1):32-33,39

[10]張素霞.菠菜葉中葉綠素提取工藝研究[J].中國食物與營養(yǎng),2008(5):40-43

[11]陳文偉,蔣家新,賈振寶,等.中心組合設(shè)計優(yōu)化綠茶色素提取研究[J].食品科技,2008,33(7):186-189

[12]童洋,肖國民,潘曉梅.響應(yīng)面法優(yōu)化螺旋藻中葉綠素的超聲提取工藝[J].化工學(xué)報,2009,60(11):2813-2819

[13]李敏.果膠酶輔助提取莖瘤芥葉片中葉綠素的工藝研究[J].安微農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(22):13380-13382

[14]李敏,余輝,姚成強.莖瘤芥葉葉綠素提取工藝研究[J].中國調(diào)味品,2012,37(2):79-82

Optimized Chlorophyll Extracting Technology from Tumorous Stem Mustard Skin

LI Min1，ZHOU Jun2，*，XIE Sheng-li1
（1.School of Life Science and Technology，Yangtze Normal University，Chongqing 408100，China；2.School of Mathematics and Computers，Yangtze Normal University，Chongqing 408100，China）

Abstract：To optimize the extraction technology of chlorophyll from skin ofBrassica junceavar.tumidaTsen et Lee by ultrasonic treating method and quadratic regression rotation-orthogonal combination design.by experiments，the regression equation of extraction rate of chlorophyll with ethanol volume fraction，materialliquid rate and ultrasonic treating time were gotten.The quatratic regression model were proved extremely significant by F-test.The equation could be used to forcast the extraction rate of chlorophyll.The optimum extraction conditions were as follows：ethanol volume fraction of 30% ，material-liquid rate of 1∶2 and ultrasonic treating time of 80 min.The study could provide theoritical reference for deep development ofBrassica junceavar.tumidaTsen et Lee.

Key words：Brassica junceavar.tumidaTsen et Lee； chlorophyll； ultrasonic treating； extraction technology

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.007

重慶市教委科技項目：利用莖瘤芥（榨菜）葉和皮筋提取葉綠素的技術(shù)研究（KJ101316）

李敏（1968—），女（苗），副教授，碩士，研究方向：食品科學(xué)。

周均（1968—），男，教授，碩士，研究方向：計算數(shù)學(xué)與應(yīng)用數(shù)學(xué)研究。

2013-05-15