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(江蘇省中醫(yī)院 檢驗科，南京 210029)

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川芎嗪降低咖啡因誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡的研究

王佳，高峰，張春兵*

(江蘇省中醫(yī)院 檢驗科，南京 210029)

目的 分析川芎嗪預(yù)處理大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤克隆化細胞株P(guān)C12細胞后咖啡因誘導(dǎo)的細胞凋亡情況，探討川芎嗪治療腦缺血再灌注損傷的機制。方法 采用川芎嗪預(yù)處理PC12細胞后，制備咖啡因細胞損傷模型,通過CCK-8法活細胞檢測、Hoechst-33342染色、流式細胞術(shù)、RT-PCR分析細胞凋亡發(fā)生機制。結(jié)果 川芎嗪預(yù)處理后，PC12細胞的存活數(shù)提高，細胞未見大量凋亡小體形成、總體凋亡率降低，caspase3、caspase-8、caspase9活性降低，線粒體膜電位提高，Bax/Bcl-2比值降低。結(jié)論 川芎嗪預(yù)處理后能降低咖啡因誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡。

川芎嗪；PC12細胞；腦缺血性損傷；凋亡

腦缺血/再灌注損傷是多種機制參與的一種復(fù)雜的病理生理過程，多種環(huán)節(jié)因素之間又互相作用。抑制腦缺血再灌注是目前有效治療腦卒中的關(guān)鍵。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMPz)能減輕腦缺血再灌注性腦損傷程度，具有顯著的缺血后腦保護作用[1]，前期研究以及其他實驗報道，川芎嗪可以穿透血腦屏障，降低缺血再灌注損傷區(qū)神經(jīng)元的凋亡。PC12細胞表達神經(jīng)生長因子(NGF)受體，NGF可誘導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)表型，廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究。鈣超載是導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡的“最后共同通路”[2]。細胞內(nèi)游離鈣的增加通常是細胞外鈣的內(nèi)流或細胞內(nèi)鈣庫釋放所致?？Х纫蚴桥d奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常用的一種黃嘌呤制劑，作為細胞肌漿網(wǎng)理阿諾堿受體(ryanodine receptor)的激動劑，能引發(fā)對ryanodine敏感的鈣庫釋放[3]。因此，咖啡因常被用于制備神經(jīng)元鈣離子超載模型[4]。本研究目的在于通過制備咖啡因PC12細胞損傷模型,探討川芎嗪腦缺血再灌注損傷保護作用與細胞凋亡的關(guān)系。

1 材料

1.1 藥品與試劑 川芎嗪：中國藥品生物制品檢定所(中國)；胎牛血清、馬血清、DMEM培養(yǎng)基：Gibco(新西蘭)；咖啡因：Sigma(美國)；明膠：Sigma(美國)；CCK-8試劑盒：Dojindo(日本)；Active Caspase-3 Staining Kit，Active Caspase-8 Staining Kit和Active Caspase-9 Staining Kit：Biovision(美國)；羅丹明：Invitrogen(美國)；RT-PCR試劑：寶生物(日本)。

1.2 PC12細胞 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞克隆株P(guān)C12細胞，購自中國科學院細胞庫(上海)。

1.3 儀器 流式細胞儀：Becton Dickinson(美國)；ABI7500實時熒光定量PCR儀：Applied Biosystems(美國)；UV2401紫外分光光度計：島津(日本)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及藥物作用

2.1.1 細胞培養(yǎng)及傳代 PC12細胞疏松貼壁生長，完全培養(yǎng)液含10% 胎牛血清和10%馬血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)于含5%CO2的37 ℃細胞培養(yǎng)箱,70%單層后傳代，以1∶4的比率傳至新細胞培養(yǎng)瓶中，2 d后半量換液。

2.1.2 咖啡因模型[1]建立 0.25%胰酶消化，制備成單細胞懸液，計數(shù)，接種到96孔培養(yǎng)板，105cells/每孔，100 μL完全培養(yǎng)液，隔天換液，生長至單層。加入5 mM咖啡因，孵育12 h后，輕輕去除培養(yǎng)基；換上不含咖啡因的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.1.3 川芎嗪保護實驗 預(yù)先用川芎嗪(0、0.1、1、10 mM)處理PC12細胞，孵育60 min后，輕輕去除培養(yǎng)基；洗滌，換液，生長至單層。

2.2 觀察指標

2.2.1 CCK-8法檢測細胞毒性 操作步驟嚴格按照試劑說明書進行。

2.2.2 Hoechst-33342染色觀察 2×105細胞接種24孔細胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)板中預(yù)先置放用明膠包被的玻片。0 mM和1 mM川芎嗪預(yù)處理后，制備細胞損傷模型，培養(yǎng)48 h，取出含有細胞單層的玻片，4 ℃用4%多聚甲醛固定10 min，加入5 μg/mL Hoechst-33342染液于玻片上，室溫避光孵育10 min,再用雙蒸水洗3遍,熒光顯微鏡觀察拍照,激發(fā)波長為350 nm。

2.2.3 流式細胞術(shù)分析Caspase-3、8、9 制備300 μL細胞懸液(105細胞/100 μL)，操作步驟嚴格按照試劑說明書進行。

2.2.4 流式細胞術(shù)觀察細胞線粒體膜電位 0.25%胰酶消化PC12細胞形成單細胞懸液,接種96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔105細胞/100 μL，加入羅丹明123染液5 μg/mL；37 ℃,5% CO2孵育15 min；完全培養(yǎng)基洗細胞2次；重懸細胞于培養(yǎng)基中，37 ℃，5% CO2孵育60 min；流式細胞儀檢測：激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。

2.2.5 實時熒光定量PCR

2.2.5.1 總RNA提取 培養(yǎng)瓶單層細胞經(jīng)0.25%胰酶消化，無菌生理鹽水洗滌3次，3 000 r/min，離心5 min收集細胞，采用TRIzol提取總RNA,操作步驟嚴格按照試劑說明書進行。

2.2.5.2 反轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)體系5×PrimescriptTMBuffer、2 μL,PrimescriptTMRT Enzyme MixⅠ、0.5 μL，Oligo dT Primer(50 uM)、0.5 μL，Random 6 mers(100 uM)、0.5 μL，Total RNA、2 μg，RNase Free H2O、6.5 μL。反應(yīng)條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。

2.2.5.3 PCR 探針及引物，Bcl-2 forward:5’-TGCGCTCAGCCCTGTG-3’，Bcl-2 reverse:5’-GGTAGCGACGAGAGAAGTCATC-3’，Bcl-2 probe:5’-CCACCTGTGGTCCACCTG-3’；Bax forward:5’-CAAGAAGCTGAGCGAGTGTCT-3’，Bax reverse:5’-CAATCATCCTCTGCAGCTCCATATT-3’，Bax probe:5’-CCAGTTCATCTCCAATTCG-3’；GAPDH forward:5’-GTGCCAA AAGGGTCATCATCTC-3’，GAPDH reverse:5’-GGTTCACACCCATCACAAACATG-3’，GAPDH probe:5’-TTCCGCTGATGCCCC-3’。探針5’標記FAM，3’標記ECLIPSE。

反應(yīng)體系(3個體系相同)：cDNA、2 μL，2×Premix EX Taq、12.5 μL，引物(10 uM)、各0.5 μL，探針、1 μL，dH2O、8.5 μL。反應(yīng)條件(3個條件相同)：95 ℃預(yù)變性45 s；95 ℃變性5 s，52 ℃退火、延伸35 s，擴增40個循環(huán)；在52 ℃退火、延伸步驟中采集熒光信號。

3 結(jié)果

3.1 川芎嗪降低咖啡因神經(jīng)細胞毒性 咖啡因具有細胞毒性。應(yīng)用不同濃度的川芎嗪處理咖啡因(5 mM)PC12細胞模型，川芎嗪呈劑量依賴性的提高細胞存活率，降低咖啡因神經(jīng)細胞毒性，P<0.05。見圖1。

3.2 川芎嗪抑制過氧化氫誘導(dǎo)的細胞凋亡

3.2.1 咖啡因(5 mM)模型中,PC12細胞的細胞核固縮，凋亡小體形成 1 mM川芎嗪預(yù)處理組，細胞核熒光強度均勻一致，未見大量凋亡小體。見圖2。

3.2.2 咖啡因致PC12損傷模型中,可以檢測到caspase-3、caspase-8和caspase9的活化；川芎嗪預(yù)處理組，caspase-3、caspase-8和caspase9的活化減弱，且呈劑量依賴性。見表1。

表1 川芎嗪調(diào)控咖啡因模型組Caspase活性

注：Group 0：0 mM 川芎嗪+0 mM咖啡因；Group 1：0 mM 川芎嗪+5 mM咖啡因；Group 2：0.1 mM川芎嗪+5 mM咖啡因；Group 3：1 mM 川芎嗪+5 mM咖啡因；Group 4:10 mM川芎嗪+5 mM咖啡因。與Group 0比較，#P<0.05；與Group 1比較，△P<0.05。

注：0M TMPz組比較，#P<0.05。

圖2 咖啡因誘導(dǎo)細胞凋亡及川芎嗪保護效應(yīng)—Hoechst 33342染色(×40倍)

3.2.3 川芎嗪對咖啡因降低線粒體膜電位具有拮抗作用 咖啡因模型組,可見熒光顯著增強，表明線粒體膜電位下降；而經(jīng)過川芎嗪預(yù)處理后，熒光強度減弱，且亦可觀察到劑量依賴性,表明川芎嗪可以劑量依賴性的提高線粒體膜電位,抑制PC12細胞凋亡。見圖3。

3.2.4 川芎嗪調(diào)控Bax/Bcl-2通路抑制細胞凋亡 咖啡因模型組,Bax/Bcl-2顯著升高，P<0.05；川芎嗪預(yù)處理后，Bax/Bcl-2呈現(xiàn)劑量依賴性降低，P<0.05。見圖4。

注：Red line(Group 0)，Green line(Group 1)，Blue line(Group 2)，Black line(Group 3)，Purple line(Group 4)，分組同表1。

注：分組同表1。與Group 0比較，#P<0.05；與Group 1比較，△P<0.05。

4 討論

腦缺血/再灌注損傷后通常出現(xiàn)神經(jīng)細胞死亡和遲發(fā)性神經(jīng)細胞死亡兩種形式，后者是一種細胞主動性死亡，稱之為凋亡，是腦缺血/再灌注損傷的最重要形式[5]。凋亡主要通過兩條途徑來實現(xiàn)的，一條是外源性途徑，又稱為死亡受體途徑，因其是通過特定的死亡配體(如FasL，TNF)與細胞表面的死亡受體(如Fas，TNFR)相互作用而介導(dǎo)的，從而激活胞內(nèi)的凋亡酶:起始酶caspase-8→caspase-3；或切割Bcl家族成員Bid蛋白→細胞色素c釋放→caspase 9→放大caspase-3活化[6]。另一條是內(nèi)源性途徑,也稱為線粒體途徑，因其通過線粒體相關(guān)的Bcl-2家族調(diào)控細胞色素c的釋放。胞漿中與Apaf-1,dATP,caspase-9前體反應(yīng)形成凋亡復(fù)合物。Caspase-9前體經(jīng)活化后激活caspase-3[7]。此途徑為脊椎動物最普遍的細胞死亡途徑。結(jié)果顯示咖啡因通過外源性和內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)PC12細胞凋亡，川芎嗪則抑制Caspase-3、8、9活化從外源性和內(nèi)源性途徑降低咖啡因誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡。

線粒體跨膜電位的降低是細胞凋亡早期的不可逆事件，在各種促細胞凋亡信號作用下，線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔不可逆過度開放，導(dǎo)致線粒體跨膜電位崩解，呼吸鏈解耦聯(lián)，線粒體基質(zhì)滲透壓升高，內(nèi)膜腫脹，釋放出膜間促凋亡蛋白，最終引起細胞凋亡。在多數(shù)條件下，線粒體內(nèi)鈣離子的過度聚積可使膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，引起線粒體功能障礙啟動神經(jīng)元的死亡和凋亡[5]。而咖啡因作為細胞肌漿網(wǎng)理阿諾堿受體的激動劑,能引發(fā)鈣庫釋放[3]，筆者觀察到咖啡因模型組，線粒體膜電位下降，而川芎嗪可抑制鈣的超載,提高線粒體膜電位，抑制細胞凋亡。

Bax屬于Bcl-2(B cell lymphoma/leukemia-2)基因家族，Bcl-2通過阻斷細胞凋亡而促進細胞存活，維持細胞生存。而Bax與Bcl-2功能相反，誘導(dǎo)細胞凋亡。Bcl-2和Bax的表達強度決定細胞命運，Bax占優(yōu)勢時促進細胞死亡，Bcl-2占優(yōu)勢時阻止細胞死亡[8]。

研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪預(yù)處理可以抑制PC12細胞凋亡，這種作用可能是通過調(diào)控caspase-3,8,9活性、線粒體膜電位及Bax/Bcl-2平衡實現(xiàn)的。

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StudyontetramethylpyrazineprotectingPC12cellfromapoptosisinducedbycaffeine

WANG Jia,GAO Feng,ZHANG Chunbing*

(Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,China)

ObjectiveTo analyze whether tetramethylpyrazine could protect PC12 cell from apoptosis induced by caffeine in order to explore the mechanism of tetramethyipyrazine in the treatment of cerebral ischemia reperfusion injury.MethodsAfter the PC12 cells were cultured by tetramethylpyrazine,caffeine was added to induce the apoptosis of PC12 cells.Various methods,including CCK-8 live cell test,Hoechst-33342 staining,flow cytometry and quantitative reverse transcription/polymerase chain reaction(RTPCR),were used to analyze the mechanisms involved in the process.ResultAfter the pretreatment,tetramethylpyrazine reduced the apoptosis of PC12 cells.The number of PC12 cells increased compared with decreased apoptosis rate.Tetramethylpyrazine could improve the activity of caspase 3,8,9 and the electric potential of mitochondrial membrane and the rate of Bax/Bcl 2 dropped in response to tetra methylpyrazine.ConclusionsThe pretreatment with tetramethylpyrazine could reduce the apoptosis of PC12 cells damaged by caffeine.

tetramethylpyrazine;PC12 cells;ischemic injury of brain;apoptosis

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.01.006

江蘇省自然科學基金資助項目(BE2010768)；國家自然科學基金資助項目(81171659)。

王 佳(1980-)，女，碩士，主管技師。研究方向：醫(yī)學免疫學研究。

] 張春兵，男，博士，主任技師，電子信箱：gaof-1218@163.com。

R285.5

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2095-6258(2014)01-0014-04

2013-09-24)

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