雷生姣，潘思軼

(1.三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，湖北宜昌443002;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070)

海藻酸(Alginate)作為一種重要的海洋生物資源，是從海帶、馬尾藻等褐藻類植物中提取的天然多糖高分子共聚物，來源豐富，其安全性已經(jīng)長期使用證實(shí)［1］。海藻酸鈉為海藻酸的鈉鹽，是一種化學(xué)物質(zhì)，具有可降解性和易于加工成膜性［2］，屬環(huán)境友好型載體材料。這些獨(dú)特物理化學(xué)性能賦予了海藻酸鈉非凡的應(yīng)用價(jià)值，近幾十年來，海藻酸鈉在食品加工［3］、紡織工業(yè)［4］、生物醫(yī)學(xué)［5－6］與環(huán)境保護(hù)［7］等領(lǐng)域中都獲得了廣泛應(yīng)用，并顯示出良好的應(yīng)用前景。海藻酸鈉的凝膠化過程即聚合物的交聯(lián)，主要是古洛糖醛酸上的鈉離子與二價(jià)陽離子交換的過程。二價(jià)陽離子有助于把分子聚集在一起，而分子聚合的本性和它們的聚合更加固了約束的陽離子，即兩者具有協(xié)同結(jié)合作用［8－9］。海藻酸鈉凝膠作為酶固定化的載體具有很多優(yōu)點(diǎn):凝膠具有很強(qiáng)的親水性，能為酶提供適宜的微環(huán)境，使固定化酶呈現(xiàn)出與游離酶相似的行為;載體本身具有極好的生物相容性，固定化凝膠的制備過程簡單，條件溫和;凝膠具有較大孔徑，酶分子與底物和產(chǎn)物具有較高的擴(kuò)散速率，酶促反應(yīng)不受擴(kuò)散限制，是應(yīng)用較廣的固定化載體。本文以海藻酸鈉為載體固定化柚(皮)苷酶，考察固定化過程中的各因素(海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶液質(zhì)量濃度、戊二醛體積分?jǐn)?shù)、交聯(lián)時(shí)間等)對(duì)固定化酶活力的影響;同時(shí)，對(duì)固定化柚(皮)苷酶的使用特性進(jìn)行研究，為固定化柚(皮)苷酶的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柚(皮)苷酶，活力 359U/g 購于 sigma－Aldrich，美國公司;98%柚皮苷，HPLC 購于sigma－Aldrich，美國公司;海藻酸鈉 上海化學(xué)試劑分裝廠;氫氧化鈉(分析純)天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;其他化學(xué)試劑均為分析純。

pH計(jì) 西德Knick公司;3000型紫外－可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;JA12002電子天平 上海天平儀器廠;SHA－BA雙功能水浴恒溫振蕩器 金壇市杰瑞爾電器有限公司;HH2型電熱恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;DHG－06－200B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 武漢海聲達(dá)儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 游離柚(皮)苷酶與海藻酸鈉固定化柚(皮)苷酶活力的測定 游離柚(皮)苷酶與固定化柚(皮)苷酶活力測定方法參照 Lei等文章［10－11］。

游離酶活力測定:5mL具塞試管中加入0.6mL底物柚皮苷(500μg/mL)和 0.3mL醋酸緩沖液(0.2mol/L，pH4.0)，在 60℃的恒溫水浴鍋中保溫5min后立即加入0.1mL柚苷酶液(2.0mg/mL)(0.2mol/L，pH4.0)，置 入 60℃ 的 恒 溫 振 蕩 器(150r/min)中準(zhǔn)確反應(yīng)30min;取出反應(yīng)液，添加4mL蒸餾水和4.9mL 90%(體積分?jǐn)?shù))一縮二乙二醇(DEG)，40℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱 3～5min，再加入4.0mol/L NaOH 0.1mL，充分搖勻，在水浴鍋中保溫發(fā)色10min;取出注入1cm比色皿內(nèi)，用紫外分光光度計(jì)在420nm處測定吸光值，通過柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力。

固定化酶活力測定:方法與游離酶活力測定基本相同，只需將酶液用1g固定化酶凝珠代替，將0.3mL緩沖液添加至0.4mL即可，其他均相同。

酶活力定義(U):在測定條件下(60℃，pH4.0)，每分鐘消耗1μg柚皮苷所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

酶的比活力:在測定條件下(60℃，pH4.0)，單位質(zhì)量酶分子所表現(xiàn)出的酶活力。

1.2.2 交聯(lián)－包埋－交聯(lián)法制備海藻酸鈉固定化柚(皮)苷酶凝珠 稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%的海藻酸鈉溶液 10g，加入柚(皮)苷酶液 1.0mL(質(zhì)量濃度1.0mg/mL)，充分混勻后，再加入體積分?jǐn)?shù)2.0%的戊二醛溶液1.0mL，充分混勻，在振蕩器(150r/min)上振蕩0.5h，靜置交聯(lián)1.5h;用5mL注射器逐滴注入不斷攪拌的質(zhì)量濃度4.0g/100mL CaCl2溶液中(100mL)，形成光滑小球后濾出小球體，更換CaCl2溶液再靜置硬化1h，濾出小球體，用緩沖液沖洗兩次;再用體積分?jǐn)?shù)0.025%的戊二醛溶液交聯(lián)2h(100mL)，濾出小球體，用緩沖液沖洗兩次，用吸水紙吸干水分得固定化酶，冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 按照1.2.2確定的參數(shù)條件，每10g載體內(nèi)添加酶液1mL，改變酶液質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL，即每克載體的承載量分別為 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mg 酶蛋白，其他條件不變，制備固定化酶。按游離酶和固定化酶活力測定方法分別測定其活力，比較載體在不同承載量時(shí)的固定化酶活力回收率。

按照1.2.2的實(shí)驗(yàn)方法和單因素實(shí)驗(yàn)確定的適宜酶液濃度，改變前交聯(lián)戊二醛溶液的體積分?jǐn)?shù)(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%)，制備固定化酶，比較不同前交聯(lián)戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶活力的影響。采用同樣的實(shí)驗(yàn)方法，改變后交聯(lián)戊二醛溶液的體積分?jǐn)?shù)(0.015%、0.020%、0.025%、0.030%、0.035%)，比較不同前交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響。

分別設(shè)定前交聯(lián)時(shí)間為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，在前述單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，制備固定化酶，比較不同前交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響。采用同樣的方法，改變后交聯(lián)時(shí)間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h)，比較不同后交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［12］，選酶液質(zhì)量濃度、前交聯(lián)戊二醛體積分?jǐn)?shù)、前交聯(lián)時(shí)間、后交聯(lián)時(shí)間為影響因素，設(shè)計(jì)了4因素3水平的表1，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，確定最佳固定化條件。

表1 海藻酸鈉固定化柚(皮)苷酶條件的L9(34)正交設(shè)計(jì)表Table 1 L9(34)Orthogonal test for immobilized naringinase in alginate sodium

1.2.5 海藻酸鈉固定化柚(皮)苷酶穩(wěn)定性研究 以正交實(shí)驗(yàn)確定的最優(yōu)固定化工藝制備固定化柚(皮)苷酶凝膠，按照酶活力測定方法，分別測定游離酶與固定酶的酶活，以酶的相對(duì)活力為目標(biāo)，依次考察固定化酶與游離酶的溫度耐受性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和固定化酶的操作穩(wěn)定性。

固定化酶與游離酶的溫度耐受性實(shí)驗(yàn)采用將適量游離酶液和固定化酶置于60℃的恒溫水浴鍋中保溫一定的時(shí)間后，取出一定量測定其活力，比較其溫度耐受性。保溫時(shí)間設(shè)定為15～180min。將制備好的固定化酶凝珠和同時(shí)配制的柚(皮)苷酶溶液(1.0mg/mL)分別置于棕色磨口試劑瓶中，冰箱內(nèi)貯藏，每隔一定的時(shí)間測定一次游離酶和固定化酶的活力。以起始酶活值為100%，計(jì)算酶的相對(duì)活力，比較固定化酶與游離酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

在5mL的具塞試管中加入1.0g海藻酸鈉溶液制備的固定化酶(27個(gè)凝珠)，再加入0.6mL的底物柚皮苷溶液(500μg/mL)和0.4mL醋酸緩沖液，置于60℃的恒溫振蕩器(150r/min)中反應(yīng)30min后，傾倒出反應(yīng)液用于測定柚皮苷含量并計(jì)算酶活力;固定化酶凝珠用0.2mol/L的醋酸－醋酸鈉緩沖液(pH4.0)洗滌至無反應(yīng)產(chǎn)物殘留，重新裝入新鮮底物溶液進(jìn)行下一批酶解反應(yīng)，以此進(jìn)行多次水解循環(huán)來測定固定化酶的重復(fù)使用性。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，采用Origin 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸鈉凝膠制備固定化柚(皮)苷酶條件優(yōu)化

2.1.1 海藻酸鈉載體固定化柚(皮)苷酶的承載量

給酶量對(duì)固定化酶活力和活力回收率的影響如圖1所示。固定化酶活力隨給酶量的增加而增加，而活力回收率隨給酶量的增加而下降。當(dāng)給酶量為0.1mg/g載體時(shí)，固定化酶活力與活力回收率均較高。當(dāng)給酶量較低時(shí)，載體將酶分子包埋在凝膠孔隙內(nèi)，酶分子與載體的活性基團(tuán)結(jié)合位點(diǎn)多［13］，大多數(shù)游離酶可結(jié)合于載體內(nèi);而且，結(jié)合的游離酶在載體孔隙內(nèi)可以充分的暴露出活性基團(tuán)，表現(xiàn)出較游離酶更高的活性，因而其活力回收率就會(huì)出現(xiàn)高于100%的情形;隨著給酶量的上升，包埋于載體內(nèi)的酶的摩爾分?jǐn)?shù)逐漸下降［14］，導(dǎo)致酶活回收率的降低。故本實(shí)驗(yàn)選擇酶液質(zhì)量濃度為1.0mg/mL，即載體承載量為0.1mg/g載體。

圖1 給酶量對(duì)固定化酶活力和活力回收率的影響Fig.1 Effect of the amount of enzyme on immobilized enzyme activity and recovery rate of immobilized enzyme

2.1.2 前交聯(lián)戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)酶固定化的影響戊二醛既是交聯(lián)劑，又是酶蛋白的變性劑，因此，其使用量直接影響固定化酶的活性和穩(wěn)定性。圖2為前交聯(lián)戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶活性的影響。由圖可知，當(dāng)前交聯(lián)戊二醛體積分?jǐn)?shù)由1.0%增加到2.0%時(shí)，固定化酶的活力也隨之增加;當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到2.0%時(shí)，固定化酶的活力達(dá)最高;體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，酶活力開始下降。但在2.0%～3.5%的戊二醛體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，對(duì)固定化酶活力影響不是很大，相對(duì)活力均保持在90%以上。這主要是因?yàn)楹Ｔ逅徕c上的活性基團(tuán)為定量的，當(dāng)絕大部分與交聯(lián)劑結(jié)合后，只有少部分的活性基團(tuán)未被結(jié)合，使得戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶相對(duì)活力影響不大。因此，本實(shí)驗(yàn)選用前交聯(lián)戊二醛最適體積分?jǐn)?shù)為2.0%。

2.1.3 前交聯(lián)時(shí)間對(duì)酶固定化的影響 前交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響如圖3所示。由圖中可以看出，海藻酸鈉固定化柚(皮)苷酶的相對(duì)活力在2.5h內(nèi)隨交聯(lián)時(shí)間延長而增大，到2.5h時(shí)達(dá)最大;后又隨著交聯(lián)時(shí)間增加而緩慢降低。并且在1.5h內(nèi)，固定化酶活力上升較快，這可能是因?yàn)樽畛鹾Ｔ逅徕c上的活性基團(tuán)較多易于與酶分子結(jié)合;1.5h后酶活基本無明顯變化。綜合考慮實(shí)驗(yàn)的便捷和實(shí)效性，本實(shí)驗(yàn)選用1.5h作為最適前交聯(lián)時(shí)間。

圖2 前交聯(lián)戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶相對(duì)活力的影響Fig.2 Effect of pre－crosslinking glutaraldehyde volume fraction on relative activity of immobilized naringianse

圖3 前交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶相對(duì)活力的影響Fig.3 Effect of pre－crosslinking time on relative activity of immobilized naringianse

2.1.4 后交聯(lián)戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)酶固定化的影響采用前交聯(lián)可以使酶分子之間以及酶分子和載體分子之間交聯(lián)，從而形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，一定程度上減少包埋后酶的滲漏［15］;采用后交聯(lián)可以使凝珠在成球過程中破壞的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)重新交聯(lián)，使膠珠表面可能存在的酶分子得以交聯(lián)而加固，避免脫落，能提高酶的重復(fù)使用性［16］。

圖4為后交聯(lián)戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)酶活力的影響。在戊二醛體積分?jǐn)?shù)范圍為0.010%～0.025%時(shí)固定化酶活力呈增加趨勢，在0.025%時(shí)達(dá)到最大;體積分?jǐn)?shù)高于0.025%后，酶活開始降低;并且在范圍0.015%～0.035%之間，固定化酶活力變化較小。由此說明后交聯(lián)戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶活力影響較小。因此，本實(shí)驗(yàn)選用后交聯(lián)戊二醛最適體積分?jǐn)?shù)為0.025%。

2.1.5 后交聯(lián)時(shí)間對(duì)酶固定化的影響 后交聯(lián)時(shí)間對(duì)海藻酸鈉固定化柚(皮)苷酶的影響如圖5所示。由圖可見，隨著后交聯(lián)時(shí)間的延長，柚(皮)苷酶的活力先增加后降低，到2h達(dá)最大。故本實(shí)驗(yàn)選用2h作為最適后交聯(lián)時(shí)間。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)確定海藻酸鈉固定化柚(皮)苷酶最優(yōu)工藝

圖4 后交聯(lián)戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶活力的影響Fig.4 Effect of after－crosslinking glutaraldehyde volume fraction on relative activity of immobilized naringianse

圖5 后交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響Fig.5 Effect of after－crosslinking time on relative activity of immobilized naringianse

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析見表2。由表2極差分析可知，影響固定化酶活力的主次因素依次A＞D＞C＞B，即酶液質(zhì)量濃度對(duì)固定化酶活力的影響最為顯著，其次依次為后交聯(lián)時(shí)間、前交聯(lián)時(shí)間、前交聯(lián)戊二醛體積分?jǐn)?shù)。四因素的最佳組合為A2B1C3D2，即酶液質(zhì)量濃度為1.0mg/mL，前交聯(lián)戊二醛體積分?jǐn)?shù)為2.0%，前交聯(lián)時(shí)間1.5h、后交聯(lián)時(shí)間2h時(shí)，固定化酶活力最高。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)所得的最佳工藝條件，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，3次實(shí)驗(yàn)的固定化酶活力分別為 5.01、5.16、5.04U/g，平均值為 5.07U/g，結(jié)果大于正交實(shí)驗(yàn)中的固定化酶活力。所以通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，說明正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)論是正確的。

表2 海藻酸鈉固定化柚(皮)苷酶L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of L9(34)orthogonal test of immobilized naringinase in alginate sodium

2.3 海藻酸鈉凝膠載體固定化柚(皮)苷酶穩(wěn)定性研究

2.3.1 海藻酸鈉固定化酶與游離酶的溫度耐受性游離酶與固定化酶在60℃時(shí)的溫度耐受性見圖7。從圖中可以看出，游離酶在60min內(nèi)酶活升高，固定化酶在45min內(nèi)酶活升高;繼續(xù)保溫后，兩種酶的活力均開始下降;游離酶在保溫180min時(shí)，相對(duì)酶活力僅為16.12%，而固定化酶相對(duì)活力為44.70%。因此海藻酸鈉固定化酶相對(duì)于游離酶而言，其熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，且隨著保溫時(shí)間的延長，其酶活力較游離酶的活力降低緩慢。這主要是因?yàn)槊阜肿庸潭ɑ螅稍谳^高的溫度下獲得最快的反應(yīng)速度，同時(shí)載體的存在也會(huì)產(chǎn)生一定的空間位阻和屏蔽作用，使得酶分子抵御外界環(huán)境變化的能力增強(qiáng)［17］。

圖7 游離酶與固定化酶在60℃時(shí)的溫度耐受性Fig.7 Temperature tolerance of free and immobilized naringinase at 60℃

2.3.2 海藻酸鈉固定化酶的操作穩(wěn)定性 固定化酶經(jīng)重復(fù)使用后，剩余相對(duì)活力如圖8所示。由圖可知，在第二次使用后，隨著酶解批數(shù)的增加，固定化酶的殘余酶活力基本趨于平衡，活力均保持在60%以上。這可能是因?yàn)榈谝淮问褂煤螅c載體結(jié)合不穩(wěn)定的游離酶均泄漏［18］，在后面的重復(fù)使用中，與載體結(jié)合牢固的酶均能表現(xiàn)出良好的活性，因而固定化酶的殘余活力基本保持不變，這說明海藻酸鈉固定化酶具備較好的重復(fù)使用性。

圖8 固定化酶的重復(fù)使用性Fig.8 Effect of number of use on immobilized naringinase

2.3.3 海藻酸鈉固定化酶與游離酶的貯藏穩(wěn)定性 固定化酶和游離酶在4℃冰箱內(nèi)貯藏后，酶活力變化趨勢如圖9所示。由圖顯示，兩種形態(tài)的酶在貯藏期間，活力都呈下降趨勢。在6d的貯藏期間，游離酶和固定化的活力下降率基本一致;但是在第15d和30d時(shí)，固定化酶的活力基本保持不變，十分穩(wěn)定，殘余活力在76%左右;游離酶的活力在6d后呈迅速下降趨勢，在第15d時(shí)基本沒有活力。表明海藻酸鈉固定化酶在本實(shí)驗(yàn)條件下，其貯藏穩(wěn)定性明顯優(yōu)于游離酶。這也與酶分子固載于海藻酸鈉凝膠網(wǎng)絡(luò)中后，其酶蛋白的空間構(gòu)型更加穩(wěn)定，對(duì)環(huán)境的抵御能力增強(qiáng)有關(guān)。

圖9 游離酶與固定化酶的貯藏穩(wěn)定性Fig.9 Storage stability of free and immobilized naringinase

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)以海藻酸鈉為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，采用交聯(lián)－包埋－交聯(lián)法對(duì)柚(皮)苷酶進(jìn)行了固定化，制備了固定化柚(皮)苷酶。研究發(fā)現(xiàn)，酶液質(zhì)量濃度、戊二醛體積分?jǐn)?shù)和交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力均有影響;并通過正交實(shí)驗(yàn)確定了海藻酸鈉凝珠固定化柚(皮)苷酶的最優(yōu)工藝條件:海藻酸鈉濃度3%，固定化酶的承載量0.1mg/g載體，前交聯(lián)戊二醛體積分?jǐn)?shù)2.0%，前交聯(lián)時(shí)間 1.5h，后交聯(lián)戊二醛體積分?jǐn)?shù)0.025%，后交聯(lián)時(shí)間2h，制備的固定化酶最高活力5.07U/g。柚(皮)苷酶經(jīng)海藻酸鈉載體固定化后，其溫度耐受性與貯藏穩(wěn)定性較游離酶有較大幅度的提高;固定化酶重復(fù)使用7次后，活力仍然保持在60%左右。

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