姚慶春 楊秀麗 鄭壽煥 李金姬

吉林松原地區(qū)CD36基因單體型與2型糖尿病的相關(guān)性研究

姚慶春 楊秀麗 鄭壽煥 李金姬

目的 對吉林松原郭爾羅斯自治縣蒙古族和漢族人群中2型糖尿病(T2MD)患者CD36內(nèi)含子3(intron 3)［TG］重復(fù)序列基因多態(tài)性分布情況進(jìn)行研究, 探討該基因多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性。方法 應(yīng)用 PCR和直接測序法對40例正常組和193例2型糖尿病患者CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列基因多態(tài)性進(jìn)行分析。結(jié)果 ①CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列有5種單體型, 即［TG］重復(fù)次數(shù)為11、12、13、15、16次。②正常組與2型糖尿病患者之間CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列各種單體型及基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。③蒙古族與漢族之間CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列各種單體型及基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。④CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列13次的單體型及基因型在蒙古族人群中正常組與2型糖尿病患者之間分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)次數(shù)13次的單體型是松原蒙古族發(fā)生2型糖尿病的危險(xiǎn)基因。

2型糖尿病；CD36；基因單體型

糖尿病是以高血糖為主要特征的內(nèi)分泌代謝性疾病, 隨著社會進(jìn)步和生活方式的改變, 糖尿病的發(fā)病率越來越高, 2000年全球糖尿病患者 2.85億, 估計(jì)到2030年全球?qū)⒔?億糖尿病患者, 其中中國約占全球的1/3。遺傳因素在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中占有重要的地位, CD36是一種多功能的清道夫受體, 與脂質(zhì)代謝及動脈硬化的發(fā)生有關(guān), 可激活細(xì)胞釋放前炎癥反應(yīng)性細(xì)胞因子、白介素等［1］。作者對吉林松原前郭爾羅斯自治縣蒙古族與漢族的健康人群和2型糖尿病患者之間CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列多態(tài)性在分布頻率進(jìn)行研究, 旨在探討該基因多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取在本院健康體檢者40名：蒙古族23名、漢族17名, 年齡(45.7±17.9)歲作為正常對照組,臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查均正常, 排除肝、腎、內(nèi)分泌和心腦血管疾病。選取2004年12月~2012年12月在本院內(nèi)分泌科住院的T2DM患者193例(蒙古族86例、漢族107例), 年齡(54.0±12.1)歲作為T2DM組。T2DM診斷依據(jù)1999年WHO制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有受檢對象均為吉林松原前郭爾羅斯自治縣地區(qū)無血緣關(guān)系個(gè)體。均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用Promega公司生產(chǎn)的Wizard@ Genomic DNA Purification Kit提取DNA。取被受檢者肘靜脈血2 ml到加有EDTA抗凝劑的真空采血管中, 并立刻顛倒混勻, 置于離心機(jī)中3000轉(zhuǎn)離心10 min, 取300 μl白細(xì)胞加入到1.5 ml離心管中, 按照細(xì)胞裂解、核裂解、RNA去除、沉淀蛋白質(zhì)、析出DNA、清洗DNA、水化DNA的過程分別加入試劑, 進(jìn)行DNA的提取。所得DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量,并置于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增基因片段 根據(jù)GenBank中所報(bào)告的序列設(shè)計(jì)CD36基因引物, 采用北京華美公司合成的引物：上游引物：5’ -ATTTATAAAAGAAGTTGCAC- 3’ 下游引物：5,-GTTTACCTACAATTTAATAA- 3’ ；PCR擴(kuò)增體系(50 μl):包括5×Green GO Taq Buffer 10 μl, MgCl22 μl, dNTP 1 μl, 上游1 μl,下游1 μl, Taq DNA聚合酶, 0.25 μl, 滅菌注射用水29.75 μl, DNA 5 μl ；PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min, 95℃變性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 循環(huán)35次, 最后72℃延伸10 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序 PCR產(chǎn)物用凝膠電泳DNA回收試劑盒純化回收DNA片段后, 送北京奧萊博生物技術(shù)有限責(zé)任公司, 完成PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列多態(tài)性各組間分布情況比較采用χ2檢驗(yàn), P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常對照組與T2DM組CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列基因多態(tài)性分布的比較 PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列有5種單體型, 即［TG］重復(fù)次數(shù)為11、12、13、15、16次, 全部為雜合子, 未發(fā)現(xiàn)純合子(見圖1)。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序結(jié)果

2.2 蒙古族與漢族2型糖尿病患者CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列單體型的分布比較 總體人群正常組與2型糖尿病患者之間CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列各種單體型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。朝鮮族與漢族之間CD36內(nèi)含子3［TG］重復(fù)序列各種單體型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但是CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列13次的單體型在蒙古族人群中正常組與2型糖尿病患者之間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.368, P<0.05), 見表1。

表1 蒙古族與漢族人群中正常組與2型糖尿病患者CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列單體型分布比較［n(%)］

2.3 蒙古族與漢族2型糖尿病患者CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列基因型的分布比較 總體人群正常組與2型糖尿病患者之間CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列各種基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。蒙古族與漢族之間CD36內(nèi)含子3［TG］重復(fù)序列各種基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但是CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列13/n的基因型在蒙古族人群中正常組與2型糖尿病患者之間分布比較, P=0.062, χ2=3.471, 見表2。

表2 蒙古族與漢族人群中正常組與2型糖尿病患者CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列基因型分布比較［n(%)］

3 討論

CD36是B類清道夫受體, 具有多種生物學(xué)功能, 參與包括炎癥、止血、免疫清除、脂質(zhì)代謝和動脈硬化在內(nèi)的許多生理和病理過程［2,3］。國內(nèi)外研究已證明CD36與動脈硬化的形成有關(guān)。Susztak等［4］在研究糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)現(xiàn)CD36的表達(dá)伴隨近端小管上皮細(xì)胞凋亡以及小管上皮細(xì)胞變性, 高糖環(huán)境刺激近端小管上皮細(xì)胞可表達(dá)CD36。Sampson等［5］研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者發(fā)現(xiàn)2型糖尿病單核細(xì)胞上CD36表達(dá)上調(diào), 認(rèn)為2型糖尿病的發(fā)生與CD36表達(dá)增強(qiáng)有一定關(guān)系。鄭壽煥等［6,7］研究認(rèn)為, 糖尿病患者血清中sCD36水平明顯升高, 且sCD36水平與血糖波動有關(guān), CD36內(nèi)含子3［TG］重復(fù)序列基因多態(tài)性與T2DM患者的發(fā)生有關(guān)。Griffin等［8］證實(shí)了葡萄糖可以通過增強(qiáng)CD36 mRNA的翻譯過程上調(diào)其蛋白質(zhì)的表達(dá), 從而進(jìn)一步上調(diào)CD36的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)也已經(jīng)證明［9］, 高血糖環(huán)境可上調(diào)CD36表達(dá)。Aase Handberg［10］等也用ELISA的方法檢測2型糖尿病患者血漿中sCD36的含量, 發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者血漿中sCD36是正常組的4.5倍, 并與胰島素抵抗有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)總體人群正常組與2型糖尿病患者之間CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列各種單體型及基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。蒙古族與漢族之間CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列各種單體型及基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但是CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列13次的單體型在蒙古族人群中正常組與2型糖尿病患者之間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。并且CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列13/n的基因型在蒙古族人群中正常組與2型糖尿病患者之間分布比較, P=0.062, χ2=3.471。根據(jù)研究結(jié)果考慮CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列13次的單體型是蒙古族發(fā)生2型糖尿病的危險(xiǎn)基因。

綜上所述, 本研究認(rèn)為CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)序列13次的單體型是蒙古族發(fā)生2型糖尿病的危險(xiǎn)基因, 而CD36內(nèi)含子3 ［TG］重復(fù)次數(shù)對CD36的表達(dá)及對2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展中的影響機(jī)制尚不明確, 需進(jìn)一步研究。

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Correlation between CD36 haplotype gene and type 2 diabetes in Jilin Songyuan region

YAO Qingchun, YANG Xiu-li, ZHEN Shou-huan, et al.Department of Endocrinology, General Hospital of Jilin Oilfield, Songyuan 138000, China

T2DM; CD36; Genetic haplotype

138000 吉林油田總醫(yī)院內(nèi)分泌科(姚慶春 楊秀麗)；吉林省延邊大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科(鄭壽煥)；遼寧丹東第一醫(yī)院(李金姬)

楊秀麗 E-mail：yangxiuli0916@163.com

【Abtract】 Objective To investigate the distribution of CD36 intron 3 ［TG］ repeat polymorphism in type 2 diabetes mellitus (T2DM) patients and to expore the correlation between the genetic polymorphism and type 2 diabetes mellitus (T2DM).Methods Genotypes of CD36 were typed in 193 T2DM patients and 40 normal person by polymerase chain reaction(PCR) and PCR-direct sequencing.Results ①Research Results found CD36 intron 3 (TG) there were five kinds of haplotype repeat sequences, namely ［TG］ repetitions for 11, 12, 13, 15, 16.②The distribution of CD36 intron 3 ［TG］ repeat genotype or haplotype has no significant difference between normal control group and T2DM group (P>0.05).③The distribution of CD36 intron 3 ［TG］ repeat genotype or haplotype has no significant difference between the Moggol nationality and the Han nationality (P>0.05).④The distribution of CD36 intron 3 ［TG］ repeat for 13 times exist statistically significant difference in the Moggol nationality between normal control group and T2DM group (P<0.05).Conclusion The distribution of CD36 intron 3 ［TG］ repeat for 13 times haplotype is a risk genes of type 2 diabetes in the Moggol nationality of songyuan region.