黃依玲 馮潔 賴茂祥

[摘要] 目的 研究?jī)擅驷樔~不同溶劑萃取部位對(duì)6種菌株的抗菌活性，為評(píng)價(jià)兩面針葉抗菌活性部位提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 應(yīng)用液體試管兩倍稀釋法測(cè)定兩面針葉不同提取部位對(duì)大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、副溶血性弧菌等菌株進(jìn)行最低抑菌濃度和最低殺菌濃度測(cè)定。 結(jié)果 乙酸乙酯部位對(duì)其中的4個(gè)菌株有抑菌活性，它們的抑菌活性依次為：副溶血性弧菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌；正丁醇部位對(duì)白色念珠菌的抑菌活性最好，其最低殺菌濃度（MBC）和最低抑菌濃度（MIC）分別為750 μg/mL和375 μg/mL；水層對(duì)副溶血性弧菌抗菌活性最強(qiáng)；其MBC和MIC分別為750 μg/mL和375 μg/mL。 結(jié)論 乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水層對(duì)白色念珠菌、副溶血性弧菌均有較好的抗菌活性，可考慮綜合應(yīng)用兩面針葉在抗菌活性方面的應(yīng)用與研究。

[關(guān)鍵詞] 兩面針葉；抗菌活性；最低抑菌濃度

[中圖分類號(hào)] R284.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）07（c）-0013-04

兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.） DC.為蕓香科花椒屬植物，作為中草藥使用在民間已有悠久歷史，其性味辛、苦、微溫，有小毒，具有祛風(fēng)通絡(luò)、活血化瘀、行氣止痛和消腫解毒之功效，用于治療牙痛、胃痛、神經(jīng)痛、咽喉腫痛、風(fēng)濕痹痛、毒蛇咬傷及燒燙傷等。兩面針作為中藥材收載于《中國(guó)藥典》2010版[1]，現(xiàn)代研究證明，兩面針的提取物具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗癌及抗菌作用[2-10]，并對(duì)心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)有顯著的藥理作用[11-12]。兩面針為廣西特色中草藥資源植物，因其臨床療效好、用途廣而至使市場(chǎng)上兩面針?biāo)幉墓┎粦?yīng)求。本研究組前期研究對(duì)兩面針根和莖的抗炎鎮(zhèn)痛不同部位活性及其抗菌部位進(jìn)行了活性研究報(bào)道[13-14]，在前期研究基礎(chǔ)上，本研究組繼續(xù)開展兩面針葉的抗菌藥理活性實(shí)驗(yàn)，為尋找活性先導(dǎo)化合物或抗菌活性化學(xué)成分及考察是否可合理地?cái)U(kuò)大兩面針?biāo)幱弥参镔Y源提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

兩面針葉采自廣西壯族自治區(qū)南寧市邕寧縣，涼干后粉碎成粗粉，生藥標(biāo)本由廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為蕓香科（Rutaceae）花椒屬植物兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.） DC.植物的葉，憑證標(biāo)本存放于廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院。兩面針葉先用70%乙醇浸泡過夜，再回流提取4次，合并提取液，減壓濃縮得稠膏，再以水一定比例的水混懸，接著用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分別依次萃取，濃縮得相應(yīng)不同極性部位稠膏，冷凍干燥，將所得的各極性部位分別記為兩面針葉的70%乙醇提取物（A）、乙酸乙酯部位（B）、正丁醇部位（C）及水層（D），并密封置冰箱中冷藏，臨用前用磷酸緩沖液（pH=6.8）加10%DMSO溶解，配成1.5 mg/mL的母液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，再逐級(jí)稀釋成不同藥液濃度。

1.1.2 菌種及培養(yǎng)基

乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、藤黃八疊球菌[CMCC（B）28001]、短小芽孢桿菌[CMCC（B）63202]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、福氏志賀菌[CMCC（B）51572]均來源于廣西食品藥品檢驗(yàn)所；表皮葡萄球菌[CMCC（B）26069]、乙型溶血性鏈球菌[ATCC17802]、單核細(xì)菌增生李斯特菌[CMCC（B）21663]、副溶血性弧菌[ATCC17802]購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。MH瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)3101197）、MH肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)201111072）購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；改良馬丁培養(yǎng)基（批號(hào)110302）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)120320）、液體沙氏培養(yǎng)基（批號(hào)101130）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)110118）及營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)110406）均為北京路橋技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器

SPX-150型生化培養(yǎng)箱、BIO1200-Ⅱ-A1生物安全柜、LRH-250-G光照培養(yǎng)箱、LMQ·C/3260J立式壓力蒸汽滅菌器。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)所用的的試管、培養(yǎng)基及溶劑等均經(jīng)高壓滅菌。

1.2.1 菌液的制備

1.2.1.1 菌種復(fù)蘇 取各凍存管中的乙型副傷寒沙門菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、單核細(xì)菌增生李斯特菌、副溶血性弧菌分別至一定量的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，混勻，并置于35～36℃下培養(yǎng)18～24 h；將取自凍存管的白色念珠菌置改良馬丁培養(yǎng)基中，混勻，23～28℃培養(yǎng)18～24 h。

1.2.1.2 實(shí)驗(yàn)菌液制備 細(xì)菌菌懸液：分別接種大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、單核細(xì)菌增生李斯特菌、副溶血性弧菌至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35～36℃下培養(yǎng)18～24 h，作為各菌株的菌懸液。使用時(shí)用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行10倍系列稀釋至所需濃度，計(jì)數(shù)。

真菌菌懸液：將白色念珠菌接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，25～28℃下培養(yǎng)24～48 h，作為菌懸液。使用時(shí)用0.9%氯化鈉溶液對(duì)其進(jìn)行10倍系列稀釋至所需濃度，計(jì)數(shù)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)（平板挖溝法） 在瓊脂平板中間挖一條寬5～10 mm的溝，注入藥液。然后分別接種乙型副傷寒沙門菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀氏菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、單核細(xì)菌增生李斯特菌、副溶血性弧菌等13個(gè)受試菌，接種時(shí)，每1種菌劃一條橫越藥溝的接種線，每個(gè)平板接種3～4種菌株。經(jīng)適宜溫度培養(yǎng)18～24 h后，觀察溝旁細(xì)菌生長(zhǎng)情況，以抑制距離的長(zhǎng)短判斷受試藥物的抑菌作用和抑菌強(qiáng)度。

1.2.2.2 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定 用0.22 μm微孔濾膜將供試藥液過濾除菌。取13支試管，每支試管加入MH肉湯培養(yǎng)基1.0 mL，再將1.0 mL供試藥液加入第1管中混勻，然后吸取1.0 mL加入第2管中混勻，同法操作稀釋至第12管，再?gòu)牡?2管中吸出1.0 mL置空試管中作空白對(duì)照，第13管作為陽(yáng)性生長(zhǎng)對(duì)照管，并將MH肉湯培養(yǎng)基和樣品溶劑各0.5 mL加入另1空試管中作為溶劑對(duì)照管。除空白對(duì)照管外，各實(shí)驗(yàn)管均分別加入相應(yīng)的菌懸液0.1 mL，各菌懸液濃度分別為：乙型副傷寒沙門菌1.3×104 CFU/mL、枯草芽孢桿菌6.1×104 CFU/mL、大腸埃希菌4.5×105 CFU/mL、副溶血性弧菌1.5×104 CFU/mL、金黃色葡萄球菌8.3×104 CFU/mL、白色念珠菌1.8×104 CFU/mL，使各實(shí)驗(yàn)液含菌終濃度為103～104 CFU/mL，混勻。將對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌的各實(shí)驗(yàn)管置于35～36℃下培養(yǎng)18～24 h，把白色念珠菌的實(shí)驗(yàn)管置25～28℃下培養(yǎng)24 h；取出觀察結(jié)果，以搖勻后仍澄明（未見長(zhǎng)菌）的最高稀釋度作為實(shí)驗(yàn)藥物的最低抑菌濃度。

1.2.2.3 最低殺菌濃度（MBC）測(cè)定 取最低抑菌濃度測(cè)定后的實(shí)驗(yàn)管，依次從對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、副溶血性弧菌實(shí)驗(yàn)未見長(zhǎng)菌的各實(shí)驗(yàn)管中，分別吸取0.1 mL的培養(yǎng)物涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基平板上，置30～35℃下培養(yǎng)24 h；再?gòu)膶?duì)白色念珠菌實(shí)驗(yàn)未見長(zhǎng)菌的實(shí)驗(yàn)管中，吸取0.1 mL培養(yǎng)物分別涂布于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，于25～28℃下培養(yǎng)24 h；取出觀察記錄結(jié)果，以平板上小于5個(gè)菌落數(shù)的最小稀釋度的藥物濃度作為最低殺菌濃度。

2 結(jié)果

2.1預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

兩面針葉藥液對(duì)上述13種受試菌株的實(shí)驗(yàn)中提示對(duì)乙型副傷寒沙門菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、副溶血性弧菌6株菌有抑菌作用。故取實(shí)驗(yàn)藥液對(duì)后者分別進(jìn)行最低抑菌濃度、最低殺菌濃度測(cè)定，同時(shí)，取硫酸慶大霉素分別對(duì)大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌，取兩性霉素B對(duì)白色念珠菌進(jìn)行最低抑菌濃度作為對(duì)照。

2.2 MIC測(cè)定結(jié)果

兩面針葉藥液乙酸乙酯部位（B）、正丁醇部位（C）及水層（D）對(duì)白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌均有不同程度的抗菌活性；對(duì)大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌無抑菌活性，70%乙醇提取物（A）對(duì)所實(shí)驗(yàn)的6種菌株未見有抑菌活性。見表1。

2.3 MBC測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)藥液乙酸乙酯部位（B）、水層（D）和正丁醇部位（C）對(duì)副溶血性弧菌和白色念珠菌的MBC均為750 μg/mL。見表1。

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)在對(duì)所研究的6個(gè)菌株中發(fā)現(xiàn)：除70%乙醇提取物，其余樣品對(duì)白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌有抗菌活性，其中對(duì)白色念珠菌、副溶血性弧菌的抗菌活性最佳，對(duì)白色念珠菌的MIC為375 μg/mL（乙酸乙酯部位、正丁醇部位）、750 μg/mL（水層），MBC為750 μg/mL（正丁醇部位）；乙酸乙酯部位、正丁醇部位對(duì)副溶血性弧菌的MIC均為375 μg/mL， MBC均為750 μg/mL；樣品乙酸乙酯部位、正丁醇部位對(duì)枯草芽孢桿菌和樣品乙酸乙酯部位、水層對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC均為750 μg/mL。

兩面針為多年生木質(zhì)藤本植物，傳統(tǒng)入藥部位為根，廣泛應(yīng)用于精細(xì)化工、醫(yī)藥產(chǎn)品及中醫(yī)處方中，因其生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，市場(chǎng)用量大，有供不應(yīng)求現(xiàn)象。文獻(xiàn)報(bào)道兩面針不同部位所含主要成分有別[15-16]，本研究組推測(cè)兩面針植物的不同入藥部位功效可能也有所不同，因而目前開展了兩面針根、莖和葉不同提取部位的抗菌和抗炎鎮(zhèn)痛活性實(shí)驗(yàn)[2，8，14]，本實(shí)驗(yàn)研究?jī)擅驷樔~的抗菌活性部位，為尋找抗菌活性化學(xué)成分或活性先導(dǎo)化學(xué)成分提供前期研究基礎(chǔ)，為兩面針植物資源的綜合利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

白色念珠菌作為重要的條件致病性真菌是引起根尖周炎，特別是頑固性根尖周炎及根管治療失敗三大菌種之一。近年來，隨著廣譜抗生素的大量使用及皮質(zhì)類固醇激素的廣泛使用，導(dǎo)致致病性白色念珠菌感染日漸增多，而抗真菌藥物的大量使用使白色念珠菌的耐藥現(xiàn)象越來越普遍，日益嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象使白色念珠菌感染成為臨床上迫切需要解決的問題[17-19]。副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）作為廣泛存在于海產(chǎn)品中的一種人畜共患病原菌，是人類食源性疾病最重要的病原之一，是細(xì)菌性食物中毒的重要致病菌。我國(guó)每年引起食物中毒的微生物病原中，該菌占首位[20]。由于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的大量使用，導(dǎo)致了副溶血性弧菌耐藥性日益嚴(yán)重[22-23]，其耐藥菌株可通過食物鏈進(jìn)入人體，給目前的臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)。尋找、研發(fā)新型的抗菌藥物迫在眉睫。

本實(shí)驗(yàn)中，兩面針葉的乙酸乙酯部位對(duì)白色念珠菌、副溶血性弧菌有較好抑菌活性，正丁醇部位對(duì)白色念珠菌、水層對(duì)副溶血性弧菌的抗菌活性最強(qiáng)，70%乙醇總提取物沒有表現(xiàn)出對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的抑菌活性，原因可能與實(shí)驗(yàn)抗菌的有效成分濃度較低有關(guān)。此研究為本研究組進(jìn)一步深入研究?jī)擅驷樫Y源、尋找新的抗白色念珠菌、抗副溶血性弧菌的抗菌活性成分或開發(fā)植物源抗菌素新藥研究提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2014-04-20 本文編輯：蘇 暢）