張巧玲+楊永強

[摘要] 目的 觀察急慢性髓系白血病患者骨髓單個核細(xì)胞β-連環(huán)蛋白的表達(dá)及其意義。 方法 41例髓系白血病患者，其中25例急性髓系白血?。ˋML），16例慢性髓系白血?。–ML）。同時選擇18例非惡性血液病患者作為對照。肝素抗凝骨髓2 ml，F(xiàn)icoll液分離骨髓單個核細(xì)胞，熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測β-連環(huán)蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 β-連環(huán)蛋白在AML組表達(dá)量明顯高于CML組及對照組（P<0.01）；CML組表達(dá)量高于對照組表達(dá)量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；CML組4例急變患者的β-連環(huán)蛋白表達(dá)量也較高。β-連環(huán)蛋白表達(dá)量與患者年齡、性別無關(guān)；與骨髓原始細(xì)胞含量有關(guān)，含量≥30%的患者β-連環(huán)蛋白表達(dá)量較高。 結(jié)論 β-連環(huán)蛋白在AML和CML急變的患者骨髓單個核細(xì)胞中異常高表達(dá)，Wnt/β-連環(huán)蛋白通路在AML和CML急變病例中異常激活可能與白血病細(xì)胞的異常增殖有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 髓系白血?。还撬鑶蝹€核細(xì)胞；β-連環(huán)蛋白

[中圖分類號] R733.7 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）07（b）-0004-04

髓系白血?。╩yeloid leukemia，ML）是造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病，分為急性髓系性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）及慢性髓系性白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）。多種癌基因、抑癌基因及其相關(guān)基因、凋亡調(diào)節(jié)基因的功能異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞分化受阻滯，惡性增殖時機體對細(xì)胞免疫監(jiān)視失常，兩方面共同奠定了ML的發(fā)病基礎(chǔ)。許多細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在ML發(fā)病機制中的作用越來越受到重視。β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種信號傳導(dǎo)分子，具有參與細(xì)胞黏附和介導(dǎo)Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的雙重功能，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1-2]，其在ML發(fā)病機制中的作用是目前研究的熱點之一[3-4]。β-連環(huán)蛋白分子在胞質(zhì)中的異常積累是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而蛋白水平的增高涉及其合成的增多與降解的減少，Wnt通路主要在蛋白降解水平上對β-連環(huán)蛋白進行調(diào)節(jié)，而對于β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)錄水平的研究國內(nèi)外報道較少。本研究應(yīng)用實時定量PCR的方法，從mRNA水平研究了β-連環(huán)蛋白在 ML中表達(dá)的差異，以探討ML患者Wnt信號途徑下游核轉(zhuǎn)錄因子β-連環(huán)蛋白與ML預(yù)后治療的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗組：2011年5月～2013年5月佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院收治門診和住院的AML及CML患者共41例，其中初治23例，復(fù)發(fā)18例；包括AML 25例，CML 16例；男性18例，女性23例；年齡15～79歲，中位年齡39歲。所有患者均經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)和細(xì)胞免疫學(xué)檢查，符合ML的診斷指標(biāo)。

對照組18例，為骨髓涂片大致正常的非惡性血液病患者，其中男性8例，女性10例，年齡19～66歲，中位年齡31歲。

1.2 主要儀器及試劑

C1000 Thermal cycler PCR儀（Bio-Rad公司）、ABI 7300熒光定量儀、Scanspeed 1730R低溫離心機（Labogene 公司），熒光定量PCR試劑、Oligod（T）Primer、Random Primer、DEPC.H2O皆為TaKaRa公司產(chǎn)品。

引物探針設(shè)計合成：GenBank上查找目的基因mRNA序列，應(yīng)用Primer Express 2.0 軟件，在CDS區(qū)設(shè)計特異性引物，序列如下：H-b-cat（擴增片段長度98 bp）正向引物：5′-TGATGGTCTGCCAAGTGGGT-3′；反向引物：5′-AAGAGCACAGATGGCAGGCT-3′。H-β-actin（擴增片段長度為106 bp）：正向引物：5′-GCATGGGTCAGAAGGATTCCT-3′；反向引物：5′-TC-GTCCCAGTTGGTGACGAT-3′。合成引物探針公司為Invitrogen公司，合成儀器為ABI 3900臺式高通量DNA合成儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 單個核細(xì)胞分離 治療前采集患者骨髓2 ml，經(jīng)肝素抗凝，F(xiàn)icoll-hypaque密度梯度離心分離單個核細(xì)胞（MNC），PBS洗滌后計數(shù)，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 全血總RNA的提取 250 μl骨髓單個核細(xì)胞液（約5×107個單核細(xì)胞）加入1.5 ml離心管中，加入800 μl Trizol振蕩15 s，再加入200 μl氯仿，振蕩15 s，室溫靜置5 min；4℃ 12 000 r/min，離心15 min。取上清液依次用酚氯仿、異丙醇提取，75%乙醇（DEPC水配制）洗滌，加DEPC處理水溶解RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 去基因組及總RNA純度檢測 使用RNase-free的DNase Ⅰ（Promega），按以下體系配置100 μl反應(yīng)液：RNA 20 μl、DNase Ⅰ 20 μl、10×Buffer 10 μl、RNase Inhibitor 0.5 μl、H2O（RNase free）49.5 μl；37℃消化30 min，65℃滅活10 min。然后依次經(jīng)等體積的苯酚、氯仿、異丙醇常規(guī)處理，收集RNA沉淀，去上清；用75%乙醇洗滌2次，超凈臺風(fēng)干；加入15～40 μl DEPC水溶解沉淀。純度檢測：取1 μl RNA樣品50倍稀釋，在島津（日本）UV-1750紫外分光光度儀上測定OD值，OD260/OD280在1.8～2.0，說明制備的RNA較純，無蛋白質(zhì)污染。

1.3.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取4 μl RNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，儀器為Bio-Rad定性PCR儀（美國），20 μl反應(yīng)體系如下：5×PrimeScriptTM Buffer （for real time）2 μl、PrimeScriptTM RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μl、Oligo dT Primer（50 μmol/L） 1 μl、Random 6 mers（100 μmol/L）2 μl、RNA模板4 μl、無RNA酶水10 μl。反應(yīng)條件37℃ 15 min，然后85℃ 5 s。

1.3.5 熒光定量PCR反應(yīng) 待測樣本按以下反應(yīng)體系進行：10×PCR緩沖液2.5 μl、dNTPs 0.5 μl、Taq 酶0.5 μl、上下引物（10 pmol/μl）各0.5 μl、cDNA 2 μl、H2O 18.5 μl。反應(yīng)條件為：93℃預(yù)變性2 min，然后93℃變性15 s，55℃ 25 s，72℃ 25 s，共40個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

相對定量法-CT值的定量方法（CT值是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）：①ΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因；②ΔΔCT=ΔCT-ΔCT最大值；③樣本的相對表達(dá)量=2-ΔΔCT

各組間的比較采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包中非參數(shù)統(tǒng)計中成組設(shè)計的t檢驗（雙側(cè)t檢驗），以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-連環(huán)蛋白樣本擴增的結(jié)果

β-連環(huán)蛋白樣本擴增的結(jié)果間圖1、2。圖1的擴增曲線反映擴增效果良好，圖2的溶解曲線顯示銳利的單一峰，說明試驗設(shè)計的反應(yīng)條件合適，擴增產(chǎn)物均一，無非特異擴增。

2.2 β-連環(huán)蛋白在髓細(xì)胞白血病中的表達(dá)

β-連環(huán)蛋白在急慢性髓系白血病中均有不同程度的表達(dá)（表1），在AML組表達(dá)量明顯高于CML組及對照組（P<0.01），5例M4患者β-連環(huán)蛋白表達(dá)均>23，最高的為M3病例，達(dá)到65.649；CML組表達(dá)量高于對照組表達(dá)量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），CML組4例急變患者的β-連環(huán)蛋白表達(dá)量也較高，分別為19.88、18.24、15.436、17.712。

2.3 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)與AML臨床特征的關(guān)系

AML骨髓β-連環(huán)蛋白表達(dá)量與患者的男女性別之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，在年齡≥60歲或<60歲的表達(dá)無關(guān)系；在骨髓原始細(xì)胞含量>30%的患者組中AML骨髓β-連環(huán)蛋白平均表達(dá)量高于原始細(xì)胞小于30%的患者組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

3 討論

Wnts蛋白是一類富含半胱氨酸殘基的分泌性糖蛋白家族，Wnt與細(xì)胞表面受體卷曲蛋白和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白家族相結(jié)合，啟動Wnt通路[5]。在正常和非增殖細(xì)胞中缺乏Wnt信號，大部分β-連環(huán)蛋白與上皮鈣黏蛋白一起連接在細(xì)胞膜上，小部分游離的β-連環(huán)蛋白也被磷酸化而失活[6]。核內(nèi)因為沒有Wnt信號傳入，DNA轉(zhuǎn)錄受到抑制，細(xì)胞增殖水平正常。異常情況下，Wnt信號或其他胞外信號刺激導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白不能被磷酸化滅活，β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)位到胞核中，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄激活劑，特異地啟動下游靶基因如c-myc、c-myb、cyclinD1、ETS等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，引起細(xì)胞增殖加快，抵抗凋亡[7]。β-連環(huán)蛋白在白血病細(xì)胞惡性增殖中的作用也不斷被證實[8]。

本研究結(jié)果顯示，在急性髓系白血病中β-連環(huán)蛋白普遍異常高表達(dá)，在CML急變患者中表達(dá)同樣異常增高，而在自身免疫性溶血性貧血、血小板減少癥等良性血液病中呈低表達(dá)；β-連環(huán)蛋白表達(dá)與患者的年齡、性別關(guān)系不大，與原始細(xì)胞的數(shù)量多少關(guān)系密切，提示W(wǎng)nt/β-連環(huán)蛋白信號通路可能在白血病細(xì)胞異常激活，與白血病細(xì)胞的惡性增殖有關(guān)。王韞秀等[9]的研究結(jié)果顯示，在AML的各亞型中M1、M2、M4、M5及M6中β-連環(huán)蛋白呈高表達(dá)，而M3中表達(dá)量較低；這與本研究結(jié)果中M3亞型同樣高表達(dá)有所區(qū)別。

近年來關(guān)于Wnt/β-連環(huán)蛋白通路在急慢性白血病中的研究逐漸增多[10]，王焱等[11]通過55例AL患者研究推測Wnt抑制因子1（WIF-1）基因啟動子甲基化及β-連環(huán)蛋白過表達(dá)參與了AL患者Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑的異常激活；有報道顯示，Wnt/β-連環(huán)蛋白通路在CML干細(xì)胞中通過調(diào)控ABCB1基因參與了多重耐藥作用[12]。Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的作用使得其在白血病治療領(lǐng)域的研究也備受重視[13]，Wang等[14]研究認(rèn)為，β-連環(huán)蛋白和蛋白激酶B（ATK）抑制劑可作為聯(lián)合治療AML的分子靶向藥物。有研究認(rèn)為，不同的腫瘤細(xì)胞對于抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的反應(yīng)不同，可能導(dǎo)致并不是所有的AML患者都適用于此項定向治療[15]。本研究結(jié)果推測Wnt/β-連環(huán)蛋白通路在AML和CML急變患者中異常激活，可能與白血病細(xì)胞的異常增殖有關(guān)；而β-連環(huán)蛋白表達(dá)量與不同亞型的AL的預(yù)后關(guān)系如何以及抑制β-連環(huán)蛋白水平對于AL的治療是否有效，都值得進一步探討研究。

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（收稿日期：2014-05-03 本文編輯：林利利）

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（收稿日期：2014-05-03 本文編輯：林利利）