陳璨　張菊　常云霞等

摘要：在單因素法初步優(yōu)化試驗基礎上，進行了Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗以及響應面分析（采用Box-Behnken法）進一步優(yōu)化了菌株zk1266的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，得到最佳培養(yǎng)基組分為：胰蛋白胨3.06%，葡萄糖385%，氯化鉀0.27%，氯化鈉0.05%，MgSO4·7H2O 0.1%，CaCl2·2H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005%，用此培養(yǎng)基對菌株進行培養(yǎng)，菌株所產(chǎn)耐熱植酸酶酶活為141.26 U/mL。菌株產(chǎn)酶能力比優(yōu)化前有了較大提高。

關鍵詞：植酸酶；Plackett-Burman設計；Box-Behnken設計；響應曲面

中圖分類號： Q939.9 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0391-03

收稿日期：2013-10-26

基金項目：周口師范學院青年科研基金（編號：2012QNA04）。

作者簡介：陳璨（1985—），男，河南周口人，碩士，講師，主要從事分子與微生物學研究。E-mail：chenc02@126.com。

通信作者：陳龍，教授，主要從事生物化學與分子生物學研究。E-mail：chenlongzg@126.com。植酸酶（phytase）是催化植酸及植酸鹽水解成磷酸（或磷酸鹽）、肌醇的一類酶[1-3]。因其可解決植酸帶來的環(huán)境及營養(yǎng)問題，植酸酶已成為飼料、酶制劑及食品添加劑領域的研究熱點[4-6]。植酸酶可代替飼料原料中所添加的大量無機磷（磷酸氫鈣等），不僅可以解決我國磷資源供應不足的問題，還可以減少生產(chǎn)無機磷的工廠數(shù)量[7]。用添加植酸酶的飼料喂養(yǎng)動物可有效減少其糞便中的磷含量，進而可解決因磷含量過多導致的土壤板結(jié)及水質(zhì)下降等問題，改善農(nóng)村農(nóng)田環(huán)境。工業(yè)制備植酸酶時，在高溫制粒這一環(huán)節(jié)中，植酸酶的熱穩(wěn)定性較差，嚴重影響植酸酶的工業(yè)化生產(chǎn)，因此進行耐熱植酸酶篩選顯得十分重要。筆者所在試驗室篩選到1株耐熱植酸酶產(chǎn)生菌。本研究以響應面法優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基，提高其耐熱植酸酶的活力，旨在為植酸酶工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

菌株zk1266分離自農(nóng)村堆肥。

1.2培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖5%，牛肉膏2%，氯化鈉005%，蒸餾水定容至100 mL，pH值自然。初始產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5%，牛肉膏2%，氯化鈉0.05%，氯化鉀005%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2·2H2O 0.05%，MnSO4·4H2O 0.01%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01%，蒸餾水定容至100 mL，pH值自然。

1.3方法

1.3.1酶活測定方法裝液量100 mL，接種量6%，45 ℃ 180 r/min培養(yǎng)50 h后測酶活，每組做3個平行，結(jié)果取平均值。參照葉冰等的酶活測定方法[8]測定植酸酶活性。

1.3.2Plackett-Burman試驗設計進行Plackett-Burman試驗設計，篩選出對酶活影響顯著的因子。裝液量100 mL，接種量6%，45 ℃ 180 r/min培養(yǎng)50 h后測酶活，每組做3個平行，結(jié)果取平均值。

1.3.3最陡爬坡試驗根據(jù)Plackett-Burman試驗篩選出的顯著因子效應大小，設計它們的步長，進行最陡爬坡試驗，確定試驗因素中心點，找到產(chǎn)酶活性最高的區(qū)域。參照“131”節(jié)的方法測酶活性。

1.3.4響應面分析采用Box-Behnken法，根據(jù)最陡爬坡試驗確定的試驗因素中心點設計響應面因素及水平。采用Minitab 15軟件對數(shù)據(jù)進行分析，得到二次線性回歸方程，分析各因素的主效應、交互效應，在一定水平范圍內(nèi)求最佳值，最后通過試驗來驗證模型的預測值與實際值是否吻合、模型是否合理。參照“1.3.1”節(jié)的方法測酶活性。

2結(jié)果與分析

2.1Plackett-Burman試驗設計結(jié)果

采用Plackett-Burman設計，從6個影響因素中篩選出具有顯著影響的因素。每個因素取2個水平：即高水平（+1）、低水平（-1）。由表1可知，葡萄糖、胰蛋白胨、氯化鉀是影響顯著的因素。

3結(jié)論

本研究表明，培養(yǎng)基最佳成分為：胰蛋白胨3.06%，葡萄糖3.85%，氯化鉀0.27%，氯化鈉0.05%，MgSO4·7H2O 01%，CaCl2·2H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005%，用此培養(yǎng)基對菌株進行培養(yǎng)，菌株所產(chǎn)耐熱植酸酶酶活為141.26 U/mL。經(jīng)過對產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行優(yōu)化后，菌株zk1266的發(fā)酵產(chǎn)酶活力有了較明顯的提高。45 ℃下，本試驗所用菌株zk1266能正常生長，若用其進行放大培養(yǎng)及進一步的工業(yè)生產(chǎn)，可以減少生產(chǎn)中污染雜菌的概率。

參考文獻：

[1]Mullaney E J，Ullah A H. The term phytase comprises several different classes of enzymes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2003，312（1）：179-184.

[2]Wodzinski R J，Ullah A. Phytase[J]. Advances in Applied Microbiology，1996，42：263-302.

[3]陳育如，劉友芬，郭月霞，等. 秸稈降解微生物在不同培養(yǎng)基中的產(chǎn)植酸酶特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2008（2）：210-212.

[4]Cao L，Wang W M，Yang C T，et al. Application of microbial phytase in fish feed[J]. Enzyme and Microbial Technology，2007，40（4）：497-507.

[5]周建琴，劉菊香. 聚乙烯醇復合固定化植酸酶方法研究[J]. 中國釀造，2009（11）：112-115.

[6]董其國，徐穩(wěn)，王恬. 不同劑量植酸酶對生長育肥豬生產(chǎn)性能和飼料養(yǎng)分利用率的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2010（4）：215-218.

[7]張莉，趙耘，王郡美. 植酸酶在飼料工業(yè)中的應用及其研究進展[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息，2006（8）：7-9.

[8]葉冰，王運吉，張苓花. 植酸酶畢赤酵母基因工程菌高密度發(fā)酵[J]. 大連輕工業(yè)學院學報，2002，21（3）：193-196.endprint

摘要：在單因素法初步優(yōu)化試驗基礎上，進行了Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗以及響應面分析（采用Box-Behnken法）進一步優(yōu)化了菌株zk1266的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，得到最佳培養(yǎng)基組分為：胰蛋白胨3.06%，葡萄糖385%，氯化鉀0.27%，氯化鈉0.05%，MgSO4·7H2O 0.1%，CaCl2·2H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005%，用此培養(yǎng)基對菌株進行培養(yǎng)，菌株所產(chǎn)耐熱植酸酶酶活為141.26 U/mL。菌株產(chǎn)酶能力比優(yōu)化前有了較大提高。

關鍵詞：植酸酶；Plackett-Burman設計；Box-Behnken設計；響應曲面

中圖分類號： Q939.9 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0391-03

收稿日期：2013-10-26

基金項目：周口師范學院青年科研基金（編號：2012QNA04）。

作者簡介：陳璨（1985—），男，河南周口人，碩士，講師，主要從事分子與微生物學研究。E-mail：chenc02@126.com。

通信作者：陳龍，教授，主要從事生物化學與分子生物學研究。E-mail：chenlongzg@126.com。植酸酶（phytase）是催化植酸及植酸鹽水解成磷酸（或磷酸鹽）、肌醇的一類酶[1-3]。因其可解決植酸帶來的環(huán)境及營養(yǎng)問題，植酸酶已成為飼料、酶制劑及食品添加劑領域的研究熱點[4-6]。植酸酶可代替飼料原料中所添加的大量無機磷（磷酸氫鈣等），不僅可以解決我國磷資源供應不足的問題，還可以減少生產(chǎn)無機磷的工廠數(shù)量[7]。用添加植酸酶的飼料喂養(yǎng)動物可有效減少其糞便中的磷含量，進而可解決因磷含量過多導致的土壤板結(jié)及水質(zhì)下降等問題，改善農(nóng)村農(nóng)田環(huán)境。工業(yè)制備植酸酶時，在高溫制粒這一環(huán)節(jié)中，植酸酶的熱穩(wěn)定性較差，嚴重影響植酸酶的工業(yè)化生產(chǎn)，因此進行耐熱植酸酶篩選顯得十分重要。筆者所在試驗室篩選到1株耐熱植酸酶產(chǎn)生菌。本研究以響應面法優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基，提高其耐熱植酸酶的活力，旨在為植酸酶工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

菌株zk1266分離自農(nóng)村堆肥。

1.2培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖5%，牛肉膏2%，氯化鈉005%，蒸餾水定容至100 mL，pH值自然。初始產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5%，牛肉膏2%，氯化鈉0.05%，氯化鉀005%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2·2H2O 0.05%，MnSO4·4H2O 0.01%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01%，蒸餾水定容至100 mL，pH值自然。

1.3方法

1.3.1酶活測定方法裝液量100 mL，接種量6%，45 ℃ 180 r/min培養(yǎng)50 h后測酶活，每組做3個平行，結(jié)果取平均值。參照葉冰等的酶活測定方法[8]測定植酸酶活性。

1.3.2Plackett-Burman試驗設計進行Plackett-Burman試驗設計，篩選出對酶活影響顯著的因子。裝液量100 mL，接種量6%，45 ℃ 180 r/min培養(yǎng)50 h后測酶活，每組做3個平行，結(jié)果取平均值。

1.3.3最陡爬坡試驗根據(jù)Plackett-Burman試驗篩選出的顯著因子效應大小，設計它們的步長，進行最陡爬坡試驗，確定試驗因素中心點，找到產(chǎn)酶活性最高的區(qū)域。參照“131”節(jié)的方法測酶活性。

1.3.4響應面分析采用Box-Behnken法，根據(jù)最陡爬坡試驗確定的試驗因素中心點設計響應面因素及水平。采用Minitab 15軟件對數(shù)據(jù)進行分析，得到二次線性回歸方程，分析各因素的主效應、交互效應，在一定水平范圍內(nèi)求最佳值，最后通過試驗來驗證模型的預測值與實際值是否吻合、模型是否合理。參照“1.3.1”節(jié)的方法測酶活性。

2結(jié)果與分析

2.1Plackett-Burman試驗設計結(jié)果

采用Plackett-Burman設計，從6個影響因素中篩選出具有顯著影響的因素。每個因素取2個水平：即高水平（+1）、低水平（-1）。由表1可知，葡萄糖、胰蛋白胨、氯化鉀是影響顯著的因素。

3結(jié)論

本研究表明，培養(yǎng)基最佳成分為：胰蛋白胨3.06%，葡萄糖3.85%，氯化鉀0.27%，氯化鈉0.05%，MgSO4·7H2O 01%，CaCl2·2H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005%，用此培養(yǎng)基對菌株進行培養(yǎng)，菌株所產(chǎn)耐熱植酸酶酶活為141.26 U/mL。經(jīng)過對產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行優(yōu)化后，菌株zk1266的發(fā)酵產(chǎn)酶活力有了較明顯的提高。45 ℃下，本試驗所用菌株zk1266能正常生長，若用其進行放大培養(yǎng)及進一步的工業(yè)生產(chǎn)，可以減少生產(chǎn)中污染雜菌的概率。

參考文獻：

[1]Mullaney E J，Ullah A H. The term phytase comprises several different classes of enzymes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2003，312（1）：179-184.

[2]Wodzinski R J，Ullah A. Phytase[J]. Advances in Applied Microbiology，1996，42：263-302.

[3]陳育如，劉友芬，郭月霞，等. 秸稈降解微生物在不同培養(yǎng)基中的產(chǎn)植酸酶特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2008（2）：210-212.

[4]Cao L，Wang W M，Yang C T，et al. Application of microbial phytase in fish feed[J]. Enzyme and Microbial Technology，2007，40（4）：497-507.

[5]周建琴，劉菊香. 聚乙烯醇復合固定化植酸酶方法研究[J]. 中國釀造，2009（11）：112-115.

[6]董其國，徐穩(wěn)，王恬. 不同劑量植酸酶對生長育肥豬生產(chǎn)性能和飼料養(yǎng)分利用率的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2010（4）：215-218.

[7]張莉，趙耘，王郡美. 植酸酶在飼料工業(yè)中的應用及其研究進展[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息，2006（8）：7-9.

[8]葉冰，王運吉，張苓花. 植酸酶畢赤酵母基因工程菌高密度發(fā)酵[J]. 大連輕工業(yè)學院學報，2002，21（3）：193-196.endprint

摘要：在單因素法初步優(yōu)化試驗基礎上，進行了Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗以及響應面分析（采用Box-Behnken法）進一步優(yōu)化了菌株zk1266的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，得到最佳培養(yǎng)基組分為：胰蛋白胨3.06%，葡萄糖385%，氯化鉀0.27%，氯化鈉0.05%，MgSO4·7H2O 0.1%，CaCl2·2H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005%，用此培養(yǎng)基對菌株進行培養(yǎng)，菌株所產(chǎn)耐熱植酸酶酶活為141.26 U/mL。菌株產(chǎn)酶能力比優(yōu)化前有了較大提高。

關鍵詞：植酸酶；Plackett-Burman設計；Box-Behnken設計；響應曲面

中圖分類號： Q939.9 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0391-03

收稿日期：2013-10-26

基金項目：周口師范學院青年科研基金（編號：2012QNA04）。

作者簡介：陳璨（1985—），男，河南周口人，碩士，講師，主要從事分子與微生物學研究。E-mail：chenc02@126.com。

通信作者：陳龍，教授，主要從事生物化學與分子生物學研究。E-mail：chenlongzg@126.com。植酸酶（phytase）是催化植酸及植酸鹽水解成磷酸（或磷酸鹽）、肌醇的一類酶[1-3]。因其可解決植酸帶來的環(huán)境及營養(yǎng)問題，植酸酶已成為飼料、酶制劑及食品添加劑領域的研究熱點[4-6]。植酸酶可代替飼料原料中所添加的大量無機磷（磷酸氫鈣等），不僅可以解決我國磷資源供應不足的問題，還可以減少生產(chǎn)無機磷的工廠數(shù)量[7]。用添加植酸酶的飼料喂養(yǎng)動物可有效減少其糞便中的磷含量，進而可解決因磷含量過多導致的土壤板結(jié)及水質(zhì)下降等問題，改善農(nóng)村農(nóng)田環(huán)境。工業(yè)制備植酸酶時，在高溫制粒這一環(huán)節(jié)中，植酸酶的熱穩(wěn)定性較差，嚴重影響植酸酶的工業(yè)化生產(chǎn)，因此進行耐熱植酸酶篩選顯得十分重要。筆者所在試驗室篩選到1株耐熱植酸酶產(chǎn)生菌。本研究以響應面法優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基，提高其耐熱植酸酶的活力，旨在為植酸酶工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

菌株zk1266分離自農(nóng)村堆肥。

1.2培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖5%，牛肉膏2%，氯化鈉005%，蒸餾水定容至100 mL，pH值自然。初始產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5%，牛肉膏2%，氯化鈉0.05%，氯化鉀005%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2·2H2O 0.05%，MnSO4·4H2O 0.01%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01%，蒸餾水定容至100 mL，pH值自然。

1.3方法

1.3.1酶活測定方法裝液量100 mL，接種量6%，45 ℃ 180 r/min培養(yǎng)50 h后測酶活，每組做3個平行，結(jié)果取平均值。參照葉冰等的酶活測定方法[8]測定植酸酶活性。

1.3.2Plackett-Burman試驗設計進行Plackett-Burman試驗設計，篩選出對酶活影響顯著的因子。裝液量100 mL，接種量6%，45 ℃ 180 r/min培養(yǎng)50 h后測酶活，每組做3個平行，結(jié)果取平均值。

1.3.3最陡爬坡試驗根據(jù)Plackett-Burman試驗篩選出的顯著因子效應大小，設計它們的步長，進行最陡爬坡試驗，確定試驗因素中心點，找到產(chǎn)酶活性最高的區(qū)域。參照“131”節(jié)的方法測酶活性。

1.3.4響應面分析采用Box-Behnken法，根據(jù)最陡爬坡試驗確定的試驗因素中心點設計響應面因素及水平。采用Minitab 15軟件對數(shù)據(jù)進行分析，得到二次線性回歸方程，分析各因素的主效應、交互效應，在一定水平范圍內(nèi)求最佳值，最后通過試驗來驗證模型的預測值與實際值是否吻合、模型是否合理。參照“1.3.1”節(jié)的方法測酶活性。

2結(jié)果與分析

2.1Plackett-Burman試驗設計結(jié)果

采用Plackett-Burman設計，從6個影響因素中篩選出具有顯著影響的因素。每個因素取2個水平：即高水平（+1）、低水平（-1）。由表1可知，葡萄糖、胰蛋白胨、氯化鉀是影響顯著的因素。

3結(jié)論

本研究表明，培養(yǎng)基最佳成分為：胰蛋白胨3.06%，葡萄糖3.85%，氯化鉀0.27%，氯化鈉0.05%，MgSO4·7H2O 01%，CaCl2·2H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005%，用此培養(yǎng)基對菌株進行培養(yǎng)，菌株所產(chǎn)耐熱植酸酶酶活為141.26 U/mL。經(jīng)過對產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行優(yōu)化后，菌株zk1266的發(fā)酵產(chǎn)酶活力有了較明顯的提高。45 ℃下，本試驗所用菌株zk1266能正常生長，若用其進行放大培養(yǎng)及進一步的工業(yè)生產(chǎn)，可以減少生產(chǎn)中污染雜菌的概率。

參考文獻：

[1]Mullaney E J，Ullah A H. The term phytase comprises several different classes of enzymes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2003，312（1）：179-184.

[2]Wodzinski R J，Ullah A. Phytase[J]. Advances in Applied Microbiology，1996，42：263-302.

[3]陳育如，劉友芬，郭月霞，等. 秸稈降解微生物在不同培養(yǎng)基中的產(chǎn)植酸酶特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2008（2）：210-212.

[4]Cao L，Wang W M，Yang C T，et al. Application of microbial phytase in fish feed[J]. Enzyme and Microbial Technology，2007，40（4）：497-507.

[5]周建琴，劉菊香. 聚乙烯醇復合固定化植酸酶方法研究[J]. 中國釀造，2009（11）：112-115.

[6]董其國，徐穩(wěn)，王恬. 不同劑量植酸酶對生長育肥豬生產(chǎn)性能和飼料養(yǎng)分利用率的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2010（4）：215-218.

[7]張莉，趙耘，王郡美. 植酸酶在飼料工業(yè)中的應用及其研究進展[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息，2006（8）：7-9.

[8]葉冰，王運吉，張苓花. 植酸酶畢赤酵母基因工程菌高密度發(fā)酵[J]. 大連輕工業(yè)學院學報，2002，21（3）：193-196.endprint