王荔華，席冬梅，李國治，胡建宏

(1.西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院,陜西 楊凌 712100;2.青海省科學技術(shù)廳,青海 西寧 810000;3.云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院,云南 昆明650201)

牦牛朊蛋白基因(Prnp)兩個位點多態(tài)性與瘋牛病抗性關(guān)系研究

王荔華1,2，席冬梅3，李國治3，胡建宏1*

(1.西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院,陜西 楊凌 712100;2.青海省科學技術(shù)廳,青海 西寧 810000;3.云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院,云南 昆明650201)

為探索牦牛Prnp基因多態(tài)對瘋牛病抗性的影響，收集288頭牦牛肝臟DNA樣品，利用PCR、酶切和電泳方法鑒定牦牛Prnp基因啟動子區(qū)域23 bp和第一內(nèi)含子區(qū)域12 bp插入/缺失(+/-)多態(tài)。結(jié)果表明，牦牛23 bp插入-插入、插入-缺失和缺失-缺失基因型的頻率分別為0.027、0.113和0.860，其插入和缺失等位基因的頻率分別為0.133和0.867；12 bp插入-插入、插入-缺失和缺失-缺失基因型的頻率分別為0.627、0.355和0.018，其插入和缺失等位基因的頻率分別為0.804和0.196。試驗表明，牦牛12 bp多態(tài)位點具有較高的插入頻率，而23 bp多態(tài)位點具有極低的插入頻率；牦牛單倍體以23-12+D23I12為主，頻率為0.692；Prnp基因23 bp和12 bp多態(tài)顯著影響Prnp基因的表達量(P<0.05)，而性別、年齡和毛色對Prnp基因的相對表達量無顯著差異(P>0.05)。本結(jié)果為今后進一步篩選抗瘋牛病牦牛奠定了基礎(chǔ)。

牦牛；朊蛋白基因；多態(tài)性；瘋牛??；抗性

瘋牛病，即牛腦海綿狀病，簡稱BSE。瘋牛病的感染因子為朊蛋白(Prion protein)，由朊蛋白基因(Bovine spongiform encephalopathy，Prnp)編碼，是一種由牛朊蛋白基因突變或其編碼蛋白(Prnp)構(gòu)象發(fā)生改變而引起的神經(jīng)退行性疾病[1-3]。1986年，該病首次在英國報道后，迅速在全球蔓延，目前已經(jīng)波及法國、德國、美國、加拿大等26個國家，對各國畜牧業(yè)造成了巨大打擊，為此各國迅速開展了相應的“斗?！庇媱漑4]。雖然目前中國還沒有類似BSE案例的報道，但毗鄰的日本于2001年報道了亞洲首例瘋牛病，現(xiàn)已經(jīng)確認40例[5-6]，對我國構(gòu)成了嚴重的威嚴，形勢不容樂觀。因此，有力開展“斗?！庇媱澘滩蝗菥廩7]。

目前，國外研究表明Prnp基因啟動子區(qū)域23 bp和第一內(nèi)含子區(qū)域12 bp插入/缺失多態(tài)與瘋牛病易感性或拮抗性存在顯著關(guān)聯(lián)；12 bp缺失干擾了與SP1轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，23 bp缺失干擾了與轉(zhuǎn)錄因子阻遏蛋白58(Repressor protein of 58KDa)的結(jié)合，進而影響了牛Prnp基因mRNA的表達、修飾或三維結(jié)構(gòu)，從而影響牛對BSE的易感性[8-10]。至今，美國、德國、斯洛伐克、日本、中國、越南、韓國等多個國家已開展了本地牛朊蛋白基因(Prnp)多態(tài)性與BSE易感性的研究[11-22]。但是，目前國外研究者只對家養(yǎng)牛(Bos taurus)—德國肉牛和日本黑牛的Prnp基因表達量進行分析驗證，在非家養(yǎng)牛(放牧)領(lǐng)域鮮有報道。

牦牛(Bos gruniens)是青藏高原高寒地區(qū)的特有牛種，主產(chǎn)中國青藏高原海拔3 000 m以上地區(qū)，適應高寒生態(tài)條件，飼養(yǎng)方式以放牧為主[23-25]。本研究以牦牛為對象，通過分子克隆技術(shù)和酶切技術(shù)鑒定牦牛Prnp基因啟動子區(qū)域23 bp和第一內(nèi)含子區(qū)域12 bp插入/缺失多態(tài)，同時對牦牛的Prnp基因表達量進行分析驗證，為非家養(yǎng)牛的瘋牛病抗病育種提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

288頭牦牛肝臟組織樣品(DNA樣品)，其中79頭(公牛50頭，母牛29頭)樣品對應有延髓組織樣品(RNA樣品)；平均年齡8.2歲。

1.2 引 物

Prnp基因啟動子區(qū)域23 bp和第一內(nèi)含子12 bp插入/缺失多態(tài)檢測的引物，熒光定量PCR擴增

肌動蛋白基因(ACTB)和Prnp基因的引物(表1)。

1.3 PCR擴增

基因DNA提取按照組織DNA提取試劑盒的步驟進行。PCR反應總體積為25 μL：12.5 μL Mix；8.5 μL ddH2O；2 μL DNA模版；1 μL引物F(10 nM)；1 μL引物R (10 nM)。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s、23 bp為54 ℃，12 bp為53 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。反應結(jié)束后4 ℃保存?zhèn)溆谩ｋ娪緳z測后每種基因型挑選3個送至中美泰和生物公司測序。將獲得的目的序列與GenBank上的序列進行比對和驗證。

表1 基因PCR引物及相關(guān)信息Table 1 Primers and related information for PCR and real time PCR of target genes

1.4 Prnp基因啟動子區(qū)域插入/缺失多態(tài)鑒定

將PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測。采用3%濃度瓊脂糖凝膠進行檢測和分析，每個樣品取2 μL點樣，同時點入2 μL DL2000(DNA Marker)，80V，電泳45 min。觀察電泳結(jié)果，統(tǒng)計Prnp啟動子區(qū)域23 bp插入/缺失多態(tài)。

1.5 Prnp基因第一內(nèi)含子區(qū)域插入/缺失多態(tài)鑒定

對12 bp插入/缺失區(qū)域的PCR擴增產(chǎn)物進行PCR-RFLP。PCR-RFLP所用的內(nèi)切酶是SacⅡ內(nèi)切酶(Fermentas公司)。1酶切反應的總體積12 μL：PCR產(chǎn)物3 μL，無菌水7.5 μL，10×Buffer B 1 μL，內(nèi)切酶0.5 μL。反應條件：37 ℃水浴16 h。然后再進行1.5%濃度的瓊脂糖凝膠電泳，80 V電泳30 min。觀察電泳結(jié)果，統(tǒng)計Prnp內(nèi)含子區(qū)域12 bp插入/缺失多態(tài)。

1.6 序列測定及分析

PCR產(chǎn)物利用DNA凝膠回收盒進行純化回收，將純化產(chǎn)物送往中美泰和公司進行序列測定，利用DNAStar和DNAMAN軟件進行序列分析。

1.7 熒光定量PCR

提取79頭牦牛延髓組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行實時熒光定量PCR反應。反應體系為20 μL：無菌蒸餾水7.2 μL、SYBR Premix Ex Taq10 μL、正反向引物各0.4 μL和cDNA 2 μL。在Bio-RadiCycler熒光定量PCR儀上進行PCR。在57 ℃檢測熒光，測定吸光值。擴增完畢后，進行溶解曲線的分析，65 ℃至95 ℃，以0.5 ℃/sec的速度逐漸升溫到95 ℃進行溶解曲線的測定，并在此升溫過程中進行熒光強度的連續(xù)檢測。對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析特異性。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均使用SPSS 16.0進行方差分析(One way ANOVA法)、多重比較(Duncan法)和相關(guān)性分析(Pearson法)，結(jié)果表示為“平均值 ± 標準差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 Prnp基因插入/缺失多態(tài)的電泳檢測

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析，條帶大小與預期擴增片段基本一致。從圖1aPrnp基因啟動子區(qū)域23bp插入/缺失的電泳檢測結(jié)果可以看出，23++基因型153 bp處只有一條帶，23--基因型在130 bp處只有一條帶，而23+-基因型有2條帶。圖1b第一內(nèi)含子區(qū)域12 bp的插入/缺失的電泳檢測結(jié)果可知，通過SacII酶切后，12 bp++基因型只有276 bp和150 bp的2條帶，12 bp--基因型在414 bp處只有1條帶，而雜合子具有明顯的3條帶。

2.2 Prnp基因插入/缺失基因型的驗證

將上述電泳檢測結(jié)果確定的基因型經(jīng)過測序(圖2)后驗證發(fā)現(xiàn)上述方法正確可靠，同時在NCBI 進行Blast比對后表明擴增產(chǎn)物為目標產(chǎn)物，可用于下一步分析。

2.3 Prnp基因插入/缺失的基因型頻率和基因頻率

288頭牦牛Prnp基因23 bp插入/插入(+/+)、插入/刪除(+/-)、刪除/刪除(-/-)基因型頻率分別為0.027、0.113和0.860，23 bp插入/插入和刪除/刪除基因頻率分別為0.133和0.867；而12 bp插入/插入、插入/刪除、刪除/刪除基因型頻率分別為0.627、0.355和0.018，12 bp插入/插入和刪除/刪除基因頻率分別為0.804和0.196。由此可見，牦牛23 bp位點以刪除為主，而12 bp位點以插入為主。

圖1 牦牛Prnp基因23 bp(a)和12 bp(b)插入/缺失的電泳檢測M.分子量;+/+是插入基因型;+/-是插入/刪除基因型;-/-是刪除基因型Fig.1 Gel electrophoresis of 23 bp insertion-deletion in the promoter (a) and 12 bp insertion-deletion in the first intron of Prnp in yak (b)M.molecular marker;+/+ is the insertation genetype;+/- shows the deletion-insertion genotype;-/- is the deletion genotype

圖2 牦牛23 bp和12 bp插入/缺失的序列檢測Fig.2 Sequence of 23 bp insertion-deletion in the promoter and 12 bp insertion-deletion in the first intron of Prnp in yak

2.4 Prnp基因插入/缺失的單倍型構(gòu)建

采用SHEsis軟件包(http://www.bio-x.cn/analysisi)對Prnp啟動子區(qū)域的23 bp和第一內(nèi)含子區(qū)域的12 bp多態(tài)位點進行單倍型構(gòu)建，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單倍型牦牛以23-12+為主，頻率為0.692，其他單倍型如23-12-、23+12+和23+12-分別為0.175、0.120和0.013。

2.5 牦牛Prnp基因和ACTB基因PCR擴增

Prnp基因和ACTB基因的PCR擴增產(chǎn)物用2 μL點樣，在1%的瓊脂糖凝膠，100V電泳30 min左右。從圖3可以看出，目的條帶分別是Prnp基因128 bp，ACTB基因143 bp，與預期結(jié)果相符，可以進新實時熒光定量PCR研究。

2.6 Prnp基因相對表達量分析

經(jīng)過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)不同性別、年齡和毛色的牦牛延髓組織中Prnp基因mRNA的相對表達量差異不顯著。由圖4可知，基因型對牦牛延髓組織中Prnp基因的相對表達量有顯著影響。牦牛延髓組織中Prnp基因在各基因型中的表達量高低順序為：23插入-插入/12插入-插入(++/++)>23插入-插入/12插入-缺失(++/+ -)>23插入-缺失/12插入-插入(+ -/++)>23插入-缺失/12插入-缺失(+ -/+ -)>23缺失-缺失/12插入-插入(--/++)>23缺失-缺失/12插入-缺失(--/+ -)。其中23插入-插入/12插入-插入(++/++)基因型的Prnp基因相對表達量最低，而23缺失-缺失/12插入-缺失(--/+ -)基因型的Prnp基因相對表達量最高。

圖3Prnp和ACTB基因的PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜
Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR products for thePrnpgene andACTBgene

圖4 不同基因型牦牛延髓組織中Prnp基因相對表達量比較Fig.4 Comparison of Prnp gene mRNA expressions in different genotype of medulla oblongata

3 討 論

3.1 Prnp基因插入/缺失的等位基因鑒定

本試驗使用兩對引物對牦牛Prnp基因23 bp和12 bp插入/缺失等位基因進行了鑒定。其中23 bp插入/缺失采用3%的瓊脂糖凝膠進行電泳，高濃度瓊脂糖凝膠能很好分離PCR產(chǎn)物(>20 bp的插入/缺失等位基因)，且條帶清晰，帶型單一。而12 bp插入/缺失采用高濃度瓊脂糖凝膠鑒定，電泳后條帶無法分離。因此，在本試驗中采用鑒定家養(yǎng)牛Prnp基因12 bp插入/缺失的方法(PCR-RFLP)進行分析[12,26]。Prnp基因12bp插入/缺失位點中有SacⅡ酶切位點，若12 bp片段插入則SacⅡ的酶切位點起作用，PCR電泳條帶帶型呈兩條帶；反之，則為一條帶。小片段的插入/缺失也可采用普通聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，無需變性，即可鑒定小片段(<20 bp)的插入/缺失等位基因。

3.2 基于Prnp基因插入/缺失多態(tài)評估BSE抗性

研究表明，能夠通過23 bp和12 bp插入/刪除頻率對不同牛種BSE的抵抗能力進行評估[8-10]。即在一般情況下，具有較低23 bp和12 bp插入頻率的牛種對BSE的抗性較低，而較高23 bp和12 bp插入頻率的牛種對BSE具有較高的抗性。本研究結(jié)果與國外BSE病牛文獻資料在相同位點上進行比較[9,13-15,17-18,26]，進一步將本次得到的數(shù)據(jù)與國內(nèi)外健康牛Prnp基因23 bp和12 bp位點的插入頻率進行系統(tǒng)比較，發(fā)現(xiàn)牦牛對BSE的抗性較低。

在本研究中，通過PCR、酶切反應及送樣測序確定了288頭牦牛Prnp基因23 bp和12 bp插入/缺失多態(tài)。同時通過熒光定量PCR反應測定79頭牦牛(延髓組織)Prnp基因的相對表達量，進而分析不同基因型、年齡、性別和毛色對Prnp基因相對表達量的影響，從而驗證了非家養(yǎng)牛中23 bp和12 bp多態(tài)影響瘋牛病的易感性，推測非家養(yǎng)牛和家養(yǎng)牛的瘋牛病抗病機理類似，該結(jié)果為非家養(yǎng)牛的抗病育種提供一定的理論基礎(chǔ)。

牦牛為青藏高原特有的畜種，發(fā)展牦牛產(chǎn)業(yè)對于提高牧區(qū)人民的生產(chǎn)生活水平具有重要意義。雖然目前沒有發(fā)現(xiàn)牦牛感染瘋牛病的報道[27-28]，但本研究通過分析牦牛與其他牛種PRNP的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)牦牛對BSE的抵抗能力較低。因此，本研究結(jié)果對于后續(xù)牦牛育種工作中篩選可能對BSE具有較高抗性的基因型或單倍型，為進一步開展抗BSE類型牦牛的選育具有重要參考價值。

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TheRelatiowshipofTwoLociPolymorphismsofthePrionProteinGeneonResistancetoBovineSpongiformEncephalopathiesinYak

WANG Li-hua1,2,XI Dong-mei3,LI Guo-zhi3,HU Jian-hong1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2.QinghaiProvincialDepartment,XiningofScienceandTechnology,Qinghai810000,China;3.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan650201,China)

The prion protein was encoded by the prion protein gene (Prnp) which is the major gene for affectingBovineSpongiformEncephalopathy(BSE) resistance.To investigate the effect of polymorphisms of the prion protein gene (Prnp) on the resistance of BSE in Yak,in the present study,we have collected liver samples from 288 yak (Bosgrunniens) and measured the polymorphisms from the 23 bp indel in promoter and the 12 bp indel in the first intron of thePrnpgene by using PCR,RFLP and electrophoresis methods.The 23bp allele has three genotypes (23+/+,23+/-,23-/-) which frequencies are 0.027,0.113 and 0.860,respectively and the allele frequencies are 0.133(I23) and 0.867 (D23).The 12bp allele also has three genotypes (12+/+,12+/-,12-/-I12/I12,I12/D12,D12/D12) which frequencies are 0.627,0.355 and 0.018,respectively.The allele frequencies are 0.804 (I12) and 0.196 (D12).These results revealed that yak has higher insertion frequency in 12 bp site but not for 23 bp site.The main haplotype is 23+12-23D-12I and the frequency is 0.692.The genotype fromPrnp23 bp and 12 bp has significantly role on the relative expression of thePrnpgene but not for gender,age and coat color.Finally,these results conducted in the present study will provide the molecular basis on the resistance to BSE for yak in future.

Yak;Prion protein gene (Prnp);polymorphism;Bovinespongiformencephalopathy(BSE);resistance

2013-10-16，

2013-12-02

王荔華(1973-)，男，陜西大荔人，本科，助理研究員，主要從事科技管理工作。E-mail：wlh1119@163.com

*[通訊作者]胡建宏(1969-)，男，陜西白水人，博士，教授，主要從事動物生殖生理調(diào)控方面的教學與科研工作。E-mail:hjh19732008@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)02-0015-06