史棟棟等

摘要基于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）技術(shù)將代謝組學(xué)的方法結(jié)合細(xì)胞周期的實驗，研究木犀草素作用于MCF7細(xì)胞的作用機理。細(xì)胞活性實驗驗證， 木犀草素對MCF7細(xì)胞有抑制作用，GCTOF/MS對加藥細(xì)胞和未加藥細(xì)胞代謝物進(jìn)行指紋圖譜分析，并進(jìn)一步應(yīng)用偏最小二乘判別分析（OPLSDA）對代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行多維統(tǒng)計分析。結(jié)合木犀草素將細(xì)胞周期抑制在S期（Synthesis），推測木犀草素通過阻礙核酸代謝中的磷酸戊糖途徑抑制MCF7細(xì)胞的增殖。

關(guān)鍵詞氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用； 細(xì)胞代謝組學(xué)； MCF7 細(xì)胞； 細(xì)胞周期； 乳腺癌； 木犀草素

1引言

細(xì)胞代謝組學(xué)是以腫瘤細(xì)胞作為代謝組學(xué)研究對象，通過體內(nèi)體外因素的作用，對生物體內(nèi)代謝物的變化進(jìn)行定量分析，尋找代謝物類型和數(shù)量變化與生理及病理變化的相互關(guān)系和動態(tài)規(guī)律＼[1＼]。用代謝組學(xué)的方法研究中藥活性物質(zhì)引起的內(nèi)源性代謝物的變化，發(fā)現(xiàn)潛在的生物代謝差異物，闡明藥物的作用機制，具有獨特的優(yōu)勢＼[2＼]。

素作用于乳腺癌MCF7細(xì)胞的機理進(jìn)行深入研究，從代謝組學(xué)的角度為木犀草素的抗腫瘤機制提供新的線索。

2實驗部分

21儀器與試劑

FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；CO2培養(yǎng)箱、全自動酶標(biāo)分析儀（美國Thermo公司）；PEGASUS 4D GC×GCTOFMS（美國LECO公司）；LNGT88臺式快速離心濃縮干燥器（太倉市華美生化儀器廠）；L35低溫冷阱（太倉市華美生化儀器廠）；XW80A漩渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；96孔培養(yǎng)板（丹麥Nunc公司）。

胎牛血清（美國Gibco公司），DMEM/HIGH GLUCOSE DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司（北京））；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、碘化丙啶（PI）、RNaseA酶、甲氧胺、2氯苯丙氨酸（Sigma公司）；二甲基亞砜（DMSO，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（HPLC級，德國Merck公司）；吡啶（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；硅烷化試劑BSTFA（含1%三甲基氯硅烷TMCS）。人乳腺癌細(xì)胞MCF7購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

22MTT實驗測藥物對細(xì)胞增殖的影響

MCF7細(xì)胞培養(yǎng)，傳3代后，取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入025%胰蛋白酶浸潤所有細(xì)胞表面后，吸出，于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃消化3～5 min。加入3 mL含血清培養(yǎng)基終止消化后，接種于96孔板，每孔100 μL（3×103～4×103個cell/孔）。培養(yǎng)12 h后，加藥，藥物濃度梯度為： 10， 25， 50， 100和200 mg/L。每孔5個平行。設(shè)置時間梯度為24，48和72 h，分別考察藥物濃度和作用 時間對細(xì)胞增殖的影響。

25數(shù)據(jù)統(tǒng)計方式

將GCMS獲得的所有原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過ChromaTOF軟件（v330， Leco Co， CA， USA）轉(zhuǎn)化成CDF格式，然后用ChromaTOF軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行峰識別、峰對齊、基線矯正、峰面積歸一化預(yù)處理。導(dǎo)入SIMCAP 115 軟件進(jìn)行多維分析。在本實驗中采用OPLSDA模型區(qū)別各組代謝物差異。結(jié)合評價OPLSDA模型質(zhì)量的3個關(guān)鍵指標(biāo)（R2X，表示模型概括X矩陣結(jié)實率；R2Y，反應(yīng)建模穩(wěn)定性；Q2Y反應(yīng)模型預(yù)測性；其中R2Y和Q2Y越接近1，說明模型穩(wěn)定性和預(yù)測性越好）。根據(jù)OPLSDA模型得到的變量權(quán)重值（Variable importance in the projection， VIP）找到潛在的代謝差異物，VIP>1。實驗中采用了t檢驗，驗證多維統(tǒng)計中得到的差異物是否具有顯著差異。搜索數(shù)據(jù)庫為NIST數(shù)據(jù)庫。

為得到更多的代謝產(chǎn)物，必須將細(xì)胞破壁，將產(chǎn)物得以釋放，才能進(jìn)一步提取。因此，細(xì)胞破碎是提取胞內(nèi)產(chǎn)物的關(guān)鍵步驟＼[7＼]。本實驗采用超聲破碎的方法，對超聲時間進(jìn)行了優(yōu)化。最后采取3 min，5 s開，5 s關(guān)進(jìn)行超聲，在這個時間內(nèi)既可以提取到多的細(xì)胞代謝物，又不會因產(chǎn)熱太多導(dǎo)致代謝物發(fā)生變化。

33基于GCTOF/MS技術(shù)的木犀草素作用于MCF7細(xì)胞后的代謝組學(xué)分析

基于細(xì)胞代謝組學(xué)中細(xì)胞代謝物的考察均是在活細(xì)胞的基礎(chǔ)之上，綜合考慮羽扇豆醇對MCF7細(xì)胞的抑制作用，最終的作用濃度為50 mg/L，作用時間24 h。GCMS優(yōu)良的定性和定量分析能力，加上其龐大的化合物譜庫，為鑒定工作帶來了很大便利，使其在代謝組學(xué)研究中具有突出優(yōu)勢＼[8，9＼]。圖2為典型的MCF7細(xì)胞的GCTOF/MS代謝物譜圖，在S/N=10時，MCF7細(xì)胞的代謝譜圖分子特征峰個數(shù)在500～600之間。

MCF7細(xì)胞分別用木犀草素作用6， 12和24 h后，在上述優(yōu)化的色譜條件下，分別對細(xì)胞樣品進(jìn)行分析，采集GCTOF/MS數(shù)據(jù)并進(jìn)行多維統(tǒng)計處理。

在上述通過代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)的差異物中，DRibose的代謝與磷酸戊糖代謝途徑（Pentose phosphate pathway）有關(guān)。磷酸戊糖途徑生成具有重要生理功能的5磷酸核糖（DRibose5phosphate）和NADPH＼[12＼]。具體為磷酸戊糖途徑以6磷酸葡萄糖開始，經(jīng)過葡糖6磷酸脫氫酶、葡萄糖內(nèi)酯水解酶、6磷酸葡萄糖酸脫氫酶的催化下生成5磷酸核酮糖，5磷酸核酮酶可以在5磷酸異構(gòu)酶的作用下生成5磷酸核糖，5磷酸核糖為核酸和核苷酸的合成提供核糖基團。DRibose的含量下降，說明其來源5磷酸核糖的含量也有所下降，從而使得合成核酸和核苷酸的原料減少，抑制了S期DNA的復(fù)制。

最直接聯(lián)系核苷酸合成和糖代謝的物質(zhì)是1磷酸葡萄糖，1磷酸葡萄糖可以在磷酸異構(gòu)酶的作用下生成6磷酸葡萄糖，從而進(jìn)行核酸的合成。核酸的合成途徑受到阻滯，導(dǎo)致大量1磷酸葡萄糖參與到糖代謝，使得DGalactose的含量大幅度生長。在核酸的酶促降解過程中會有磷酸生成，推測木犀草素抑制了核酸酶及其核酸苷酶的活性，從而使磷酸（Phosphoric Acid）的含量下降。

綜合分析，核酸是承載物體遺傳信息的構(gòu)成細(xì)胞的最重要的成分。木犀草素可能主要阻滯了核酸的代謝。

4結(jié)論

以GCMS聯(lián)用技術(shù)為平臺，通過多元統(tǒng)計分析等手段探索了木犀草素作用后MCF7細(xì)胞后細(xì)胞代謝物的變化。結(jié)果表明，加藥組和未加藥組存在顯著的差異，對具有顯著性差異的物質(zhì)進(jìn)行分析，得到了DRibose、DGalactose和Phosphoric Acid等10種代謝差異物。結(jié)合木犀草素將MCF7細(xì)胞抑制在S期（主要進(jìn)行DNA的復(fù)制）的細(xì)胞實驗結(jié)果，推測木犀草素主要通過阻滯磷酸戊糖代謝途徑中酶的活性來抑制細(xì)胞的增殖。

本研究利用代謝組學(xué)的方法研究中藥活性物質(zhì)作用于細(xì)胞的生物化學(xué)變化，并且與傳統(tǒng)手段的測定結(jié)果相聯(lián)系，為藥物的機理研究提供了一種新的有效平臺。

王洪燕， 全 康， 蔣燕靈， 吳加國， 唐修文 浙江大學(xué)學(xué)報， 2010， 39（1）： 30-36

6Sana T R， Waddell K， Fischer S M J Chromatogr B， 2008， 871： 314

7MendesPinto M M， Raposo M F J J App Phycol， 2001， 13： 19-24

8Lenz E M， Wilson I D Journal of Proteome Research， 2007， 6（2）： 443-458

9Jonsson P， Stenlund H， Moritz T， Trygg J， Sjstrm M， Verheij E R， Lindberg J， SchuppeKoistinen I， Antti H Metabolomics， 2006， 2（3）： 135-143

10Murray R K， Granner D K， Mayes P A Harpers hiochemistry， New York： McGraw Hill， 2000： 600-616

11Dumas M E， Barton R H， Toye A， Cloarec O， Blancher C， Rothwell A， Fearnside J， Tatoud R， Blanc V， Lindon J C， Mitchell S C， Holmes E， McCarthy M I， Scott J， Gauguier D， Nicholson J K Proc Natl Acal Sci USA， 2006， 103（33）： 12511-12516

12JIA Wei Medical Metabonomics Shanghai： Shanghai Science and Technique Publishing House， 2011： 78-83

AbstractThe metabolic profiles of control and MCF7 cells treated with luteolin were analyzed separately using gas chromatography/mass spectrometry （GC/MS） to study the mechanism of the luteolin treatment on MCF7 cells Cell viability assays showed that luteolin had inhibition effect on MCF7 cells Partial least square discriminant analysis （OPLSDA） was used to process the metabolic data Since cells in phase of S were increased significantly， we speculated that luteolin had a blocking effect on pentose phosphate pathway of MCF7 cells， which contributed to its inhibition effect on proliferation of MCF7 cells

KeywordsGas chromatography/mass spectrometry； Cell metabonomics； MCF7 cells； Cell cycle； Breast cancer； Luteolin

綜合分析，核酸是承載物體遺傳信息的構(gòu)成細(xì)胞的最重要的成分。木犀草素可能主要阻滯了核酸的代謝。

4結(jié)論

以GCMS聯(lián)用技術(shù)為平臺，通過多元統(tǒng)計分析等手段探索了木犀草素作用后MCF7細(xì)胞后細(xì)胞代謝物的變化。結(jié)果表明，加藥組和未加藥組存在顯著的差異，對具有顯著性差異的物質(zhì)進(jìn)行分析，得到了DRibose、DGalactose和Phosphoric Acid等10種代謝差異物。結(jié)合木犀草素將MCF7細(xì)胞抑制在S期（主要進(jìn)行DNA的復(fù)制）的細(xì)胞實驗結(jié)果，推測木犀草素主要通過阻滯磷酸戊糖代謝途徑中酶的活性來抑制細(xì)胞的增殖。

本研究利用代謝組學(xué)的方法研究中藥活性物質(zhì)作用于細(xì)胞的生物化學(xué)變化，并且與傳統(tǒng)手段的測定結(jié)果相聯(lián)系，為藥物的機理研究提供了一種新的有效平臺。

王洪燕， 全 康， 蔣燕靈， 吳加國， 唐修文 浙江大學(xué)學(xué)報， 2010， 39（1）： 30-36

6Sana T R， Waddell K， Fischer S M J Chromatogr B， 2008， 871： 314

7MendesPinto M M， Raposo M F J J App Phycol， 2001， 13： 19-24

8Lenz E M， Wilson I D Journal of Proteome Research， 2007， 6（2）： 443-458

9Jonsson P， Stenlund H， Moritz T， Trygg J， Sjstrm M， Verheij E R， Lindberg J， SchuppeKoistinen I， Antti H Metabolomics， 2006， 2（3）： 135-143

10Murray R K， Granner D K， Mayes P A Harpers hiochemistry， New York： McGraw Hill， 2000： 600-616

11Dumas M E， Barton R H， Toye A， Cloarec O， Blancher C， Rothwell A， Fearnside J， Tatoud R， Blanc V， Lindon J C， Mitchell S C， Holmes E， McCarthy M I， Scott J， Gauguier D， Nicholson J K Proc Natl Acal Sci USA， 2006， 103（33）： 12511-12516

12JIA Wei Medical Metabonomics Shanghai： Shanghai Science and Technique Publishing House， 2011： 78-83

AbstractThe metabolic profiles of control and MCF7 cells treated with luteolin were analyzed separately using gas chromatography/mass spectrometry （GC/MS） to study the mechanism of the luteolin treatment on MCF7 cells Cell viability assays showed that luteolin had inhibition effect on MCF7 cells Partial least square discriminant analysis （OPLSDA） was used to process the metabolic data Since cells in phase of S were increased significantly， we speculated that luteolin had a blocking effect on pentose phosphate pathway of MCF7 cells， which contributed to its inhibition effect on proliferation of MCF7 cells

KeywordsGas chromatography/mass spectrometry； Cell metabonomics； MCF7 cells； Cell cycle； Breast cancer； Luteolin

綜合分析，核酸是承載物體遺傳信息的構(gòu)成細(xì)胞的最重要的成分。木犀草素可能主要阻滯了核酸的代謝。

4結(jié)論

以GCMS聯(lián)用技術(shù)為平臺，通過多元統(tǒng)計分析等手段探索了木犀草素作用后MCF7細(xì)胞后細(xì)胞代謝物的變化。結(jié)果表明，加藥組和未加藥組存在顯著的差異，對具有顯著性差異的物質(zhì)進(jìn)行分析，得到了DRibose、DGalactose和Phosphoric Acid等10種代謝差異物。結(jié)合木犀草素將MCF7細(xì)胞抑制在S期（主要進(jìn)行DNA的復(fù)制）的細(xì)胞實驗結(jié)果，推測木犀草素主要通過阻滯磷酸戊糖代謝途徑中酶的活性來抑制細(xì)胞的增殖。

本研究利用代謝組學(xué)的方法研究中藥活性物質(zhì)作用于細(xì)胞的生物化學(xué)變化，并且與傳統(tǒng)手段的測定結(jié)果相聯(lián)系，為藥物的機理研究提供了一種新的有效平臺。

王洪燕， 全 康， 蔣燕靈， 吳加國， 唐修文 浙江大學(xué)學(xué)報， 2010， 39（1）： 30-36

6Sana T R， Waddell K， Fischer S M J Chromatogr B， 2008， 871： 314

7MendesPinto M M， Raposo M F J J App Phycol， 2001， 13： 19-24

8Lenz E M， Wilson I D Journal of Proteome Research， 2007， 6（2）： 443-458

9Jonsson P， Stenlund H， Moritz T， Trygg J， Sjstrm M， Verheij E R， Lindberg J， SchuppeKoistinen I， Antti H Metabolomics， 2006， 2（3）： 135-143

10Murray R K， Granner D K， Mayes P A Harpers hiochemistry， New York： McGraw Hill， 2000： 600-616

11Dumas M E， Barton R H， Toye A， Cloarec O， Blancher C， Rothwell A， Fearnside J， Tatoud R， Blanc V， Lindon J C， Mitchell S C， Holmes E， McCarthy M I， Scott J， Gauguier D， Nicholson J K Proc Natl Acal Sci USA， 2006， 103（33）： 12511-12516

12JIA Wei Medical Metabonomics Shanghai： Shanghai Science and Technique Publishing House， 2011： 78-83

AbstractThe metabolic profiles of control and MCF7 cells treated with luteolin were analyzed separately using gas chromatography/mass spectrometry （GC/MS） to study the mechanism of the luteolin treatment on MCF7 cells Cell viability assays showed that luteolin had inhibition effect on MCF7 cells Partial least square discriminant analysis （OPLSDA） was used to process the metabolic data Since cells in phase of S were increased significantly， we speculated that luteolin had a blocking effect on pentose phosphate pathway of MCF7 cells， which contributed to its inhibition effect on proliferation of MCF7 cells

KeywordsGas chromatography/mass spectrometry； Cell metabonomics； MCF7 cells； Cell cycle； Breast cancer； Luteolin