郭時(shí)金，徐倩倩，付石軍，周春鳳，王艷萍，沈志強(qiáng)*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都安特動(dòng)物藥業(yè)有限公司，山東 濱州 256600)

清瘟敗毒顆粒的急性和亞慢性毒性試驗(yàn)研究

郭時(shí)金1,2，徐倩倩1,2，付石軍1,2，周春鳳1,2，王艷萍1,2，沈志強(qiáng)1,2*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都安特動(dòng)物藥業(yè)有限公司，山東 濱州 256600)

在急性毒性試驗(yàn)中，給予試驗(yàn)組小鼠不同濃度的清瘟敗毒顆粒水溶液，測(cè)定清瘟敗毒顆粒的半數(shù)致死量和最大耐受量；在亞慢性毒性試驗(yàn)中，試驗(yàn)組大鼠以88，44，22 g/(kg·d)的劑量連續(xù)經(jīng)口給藥42 d，并另設(shè)灌服生理鹽水對(duì)照組，在給藥后觀察大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育、血液學(xué)和血液生化、臟器病理學(xué)變化。結(jié)果顯示，急性毒性試驗(yàn)沒能測(cè)出清瘟敗毒顆粒的半數(shù)致死量；小鼠經(jīng)口灌服受試藥物的最大耐受量高于132 g/(kg·d)；在亞慢性毒性試驗(yàn)期間，各給藥組大鼠體重、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異。急性毒性試驗(yàn)表明清瘟敗毒顆粒無(wú)急性毒性；亞慢性毒性試驗(yàn)表明連續(xù)口服給藥較安全。

清瘟敗毒顆粒；急性毒性試驗(yàn)；最大耐受量試驗(yàn)；亞慢性毒性試驗(yàn)

清瘟敗毒飲是清代著名溫病學(xué)家余師愚所創(chuàng)制的名方，載于其所著的《疫疹一得》書中。處方由生石膏、小生地、烏犀角、真川連、梔子、桔梗、黃芩、知母、赤芍、玄參、連翹、甘草、丹皮、鮮竹葉共十四味中藥煎煮而成。處方是由白虎湯、黃連解毒湯和犀角地黃湯三副湯劑組成的復(fù)方，藥性專一，作用全面，功在清熱解毒，瀉火涼血[1]?，F(xiàn)代研究已報(bào)道，清瘟敗毒飲具有抑制早期膿毒癥患者過度免疫應(yīng)答、減少過度免疫應(yīng)答對(duì)機(jī)體自身的損害[2]、改善細(xì)胞免疫水平[3-4]、有較強(qiáng)的抑菌作用[5]。清瘟敗毒散對(duì)雞白痢[6]、豬高致病性藍(lán)耳病[7]有良好地防治效果。

清瘟敗毒顆粒是在清瘟敗毒飲基礎(chǔ)上對(duì)其中主要成分進(jìn)行單獨(dú)提取，并在此基礎(chǔ)上通過科學(xué)工藝制備的顆粒劑。前期研究工作顯示，清瘟敗毒顆粒有很好的抗菌活性[8]，為了進(jìn)一步探討其安全性，本研究通過急性毒性試驗(yàn)、最大耐受試驗(yàn)、亞慢性毒性試驗(yàn)對(duì)其毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，為臨床安全應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

血液生化測(cè)定試劑盒包括谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST，批號(hào)111206)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT，批號(hào)120321)、堿性磷酸酶(ALP，批號(hào)120214)、白蛋白(ALB，批號(hào)111220)、總蛋白(TP，批號(hào)120311)、尿酸氨(BUN，批號(hào)111128)、肌酐(CRE，批號(hào)120215)、總膽紅素(TBIL，批號(hào)120307)，以上試劑均采用上海百祥生物科技有限公司產(chǎn)品。主要設(shè)備包括AUTOLAB-1.0全自動(dòng)生化分析儀、ACS-30電子天平和血細(xì)胞計(jì)數(shù)板。

1.2 試驗(yàn)藥物

清瘟敗毒顆粒，1.3 g生藥/g顆粒。批號(hào)20120210，經(jīng)檢驗(yàn)合格，由山東綠都安特動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明系小白鼠，雌雄各半，體重18～22 g。在人工照明12 h，通風(fēng)良好情況下飼養(yǎng)觀察7 d；8周清潔級(jí)SD大鼠120只，雌雄各半，體重在210～240 g之間，均由山東大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為：SCXK(魯)20090001。室溫18 ℃～25 ℃，相對(duì)濕度60%，室內(nèi)無(wú)對(duì)流風(fēng)。

1.4 急性毒性試驗(yàn)

1.4.1 方法 小鼠64只，隨機(jī)分為8組，每組8只，雌雄各半，禁食不禁水12 h；將顆粒配制成不同濃度，一日三次，以最大給藥體積0.8 mL/只，口服給藥，給藥劑量分別為11.6、17.4、26.1、39.1、58.7、88.0、132.0 g/(kg·d)及生理鹽水對(duì)照組，連續(xù)觀察7 d，詳細(xì)記錄動(dòng)物毒性反應(yīng)情況和死亡情況，計(jì)算半數(shù)致死量(LD50)的置信區(qū)間[8]。

1.4.2 評(píng)價(jià)指標(biāo) 記錄中毒癥狀、中毒發(fā)生時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、恢復(fù)期、死亡數(shù)量等；對(duì)死亡動(dòng)物及時(shí)進(jìn)行尸檢，記錄病變情況。

1.5 最大耐受量試驗(yàn)

1.5.1 方 法 小鼠30只，禁食不禁水12 h，隨機(jī)分為4組，即高、中、低和生理鹽水對(duì)照組，給藥劑量分別為132、66、33 g/(kg·d)，連續(xù)觀察7 d。

1.5.2 評(píng)價(jià)指標(biāo) 記錄中毒癥狀、中毒發(fā)生時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、恢復(fù)期、死亡數(shù)量等；對(duì)死亡動(dòng)物及時(shí)進(jìn)行尸檢，記錄病變情況；試驗(yàn)結(jié)束后每組小鼠脫頸處死，觀察各臟器的病理變化。

1.6 亞慢性毒性試驗(yàn)

1.6.1 給藥劑量與分組 將大鼠隨機(jī)分為4組，每組30只，雌雄各半，即高、中、低劑量組和生理鹽水對(duì)照組，給藥劑量分別為88、44、22 g/(kg·d)。組內(nèi)動(dòng)物個(gè)體體重相差不超過平均體重的10%，組間平均體重相差不超過5%。

1.6.2 給藥方法 根據(jù)清瘟敗毒顆粒的用藥原則，采用口服給藥，連續(xù)給藥42 d。根據(jù)體重和劑量組進(jìn)行灌服給藥，每天定時(shí)進(jìn)行，每周稱重1次，并按體重變化調(diào)整給藥量。

1.6.3 檢查項(xiàng)目與方法

1.6.3.1 一般指標(biāo) 每天觀察大鼠的健康狀況、采食及飲水、體重變化等變化。分別于第1、2、3、4、5、6周稱量體重，將給藥劑量組與對(duì)照組進(jìn)行比較和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。及時(shí)記錄和分析大鼠的中毒癥狀及出現(xiàn)各癥狀的先后次序、時(shí)間。

1.6.3.2 血液學(xué)檢測(cè) 給藥結(jié)束后靜脈采血，測(cè)定血紅蛋白(Hg)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(Ec)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(Lc)，嗜中性粒細(xì)胞(NL)、嗜酸性粒細(xì)胞(AL)、嗜堿性粒細(xì)胞(BL)、淋巴細(xì)胞(LM)、單核細(xì)胞(ML)。

1.6.3.3 血液生化指標(biāo)檢測(cè) 給藥結(jié)束后靜脈采血分離血清，檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)換酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、總蛋白(TP)、總膽固醇(CHO)。

1.6.3.4 臟器系數(shù) 試驗(yàn)結(jié)束后，各組取10只大鼠(雌雄各半)進(jìn)行處死，對(duì)處死的大鼠進(jìn)行全面系統(tǒng)的剖檢，對(duì)大鼠體重及各主要臟器(包括心、肝、脾、肺、腎、睪丸及卵巢)重量，做好記錄。計(jì)算各臟器的相對(duì)重量(臟器重/體重)，即臟器系數(shù)。

1.6.3.5 組織病理學(xué)檢查 對(duì)高劑量組及對(duì)照組大鼠(如有異常則包括中、低劑量組)的主要臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。組織病理學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目包括：心、肝、腎、脾、睪丸(♂)及卵巢(♀)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 急性毒性試驗(yàn)

給藥后小鼠飲食正常，體重增加，活動(dòng)自如，皮毛光滑，大小便正常，無(wú)異常分泌物，無(wú)任何不良反應(yīng)。觀察7 d，動(dòng)物均無(wú)死亡，經(jīng)大體解剖和病理檢查，主要臟器無(wú)異常。

2.2 最大耐受量試驗(yàn)

急性毒性試驗(yàn)表明給藥劑量達(dá)到132 g/(kg·d)時(shí)，小鼠沒有出現(xiàn)死亡和中毒現(xiàn)象，同時(shí)由于受給藥體積和濃度的限制，難以測(cè)出LD50，故進(jìn)行小鼠的最大耐受量測(cè)定[9]。

以最大灌胃容量給予清瘟敗毒顆粒，劑量最大達(dá)到132 g/(kg·d)，連續(xù)觀察7 d，動(dòng)物全部存活，飲食正常，體重增加，活動(dòng)自如，皮毛光滑，大小便正常，無(wú)異常分泌物，無(wú)任何不良反應(yīng)。剖檢觀察主要臟器未見異常。

2.3 亞慢性毒性試驗(yàn)

2.3.1 一般狀況 試驗(yàn)期間，3個(gè)劑量組大鼠活動(dòng)自如，皮毛光滑，大小便正常，無(wú)異常分泌物，無(wú)任何不良反應(yīng)，未出現(xiàn)死亡。3個(gè)劑量組大鼠給藥結(jié)束，體重與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)見表1。

2.3.2 血液學(xué)及血液生化指標(biāo)檢查 給藥結(jié)束后，各組大鼠進(jìn)行血液學(xué)和血液生化參數(shù)測(cè)定結(jié)果分別見表2和表3。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，與對(duì)照組相比清瘟敗毒顆粒各劑量組的血液學(xué)和血液生化參數(shù)之間差異不顯著(P>0.05)。

2.3.3 剖檢觀察和臟器系數(shù) 給藥結(jié)束后，大剖檢鼠，經(jīng)肉眼觀察均未發(fā)現(xiàn)任何異常和可疑病變。將清瘟敗毒顆粒高劑量組和對(duì)照組大鼠的肝、腎、脾、胃腸、睪丸(♂)及卵巢(♀)組織進(jìn)行組織病理學(xué)切片檢查，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)異常的組織病理學(xué)變化。給藥結(jié)束，三種不同劑量組各臟器系數(shù)與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)見表4。

表1 清瘟敗毒顆粒對(duì)大鼠體重增重的影響Table 1 Influence of Qingwen Baidu Granules to weight increment of rats

表2 清瘟敗毒顆粒對(duì)大鼠血液學(xué)檢測(cè)指標(biāo)Table 2 Influence of Qingwen Baidu Granules to hematology detection index of rats

表3 清瘟敗毒顆粒對(duì)大鼠血液生化學(xué)檢測(cè)指標(biāo)Table 3 Influence of Qingwen Baidu Granules to blood biochemical detection index of rats

表4 清瘟敗毒顆粒對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響Table 4 Influence of Qingwen Baidu Granules to Organ coefficients of rats

3 討論與結(jié)論

清瘟敗毒顆粒由石膏、知母、梔子、黃連、黃芩、連翹等十四味中藥經(jīng)提取精制而成，具有突出的瀉火解毒，涼血等作用。清瘟敗毒飲在人類醫(yī)學(xué)臨床中未見不良反應(yīng)發(fā)生，但是由于中藥提取工藝不同，有效成分及含量亦不同，其毒副作用亦有區(qū)別。所以對(duì)清瘟敗毒顆粒進(jìn)行了小鼠的急性毒性試驗(yàn)和大鼠的亞慢性毒性試驗(yàn)。

3.1 清瘟敗毒顆粒對(duì)小鼠的急性毒性

急性毒性試驗(yàn)是指一次或24 h內(nèi)多次染毒的試驗(yàn)，是毒性研究的第一步。要求采用嚙齒類或非嚙齒類兩種動(dòng)物。通常為小鼠或大鼠采用經(jīng)口、吸入或經(jīng)皮染毒途徑。觀察藥物對(duì)小鼠的毒性反應(yīng),同時(shí)考察小鼠的急性毒性反應(yīng)情況、中毒死亡的原因及特征，以期對(duì)制劑的毒性做出評(píng)價(jià)。本次急性毒性試驗(yàn)，由于受給藥體積和濃度的限制，未能測(cè)定出清瘟敗毒顆粒對(duì)小鼠的LD50，所以進(jìn)行了最大耐受量試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠灌服清瘟敗毒顆粒132 g/(kg·d)[生藥量171.6 g/(kg·d)]后觀察7 d，也未見死亡，剖檢觀察主要臟器，均未見異常。因此小鼠對(duì)清瘟敗毒顆粒的最大耐受量超過132 g/(kg·d)[生藥量171.6 g/(kg·d)]。

3.2 清瘟敗毒顆粒的亞慢性毒性

亞慢性毒性是指試驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)多日接觸較大劑量的外來化合物所出現(xiàn)的中毒效應(yīng)。主要是探討長(zhǎng)期用藥后，對(duì)機(jī)體所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度、主要的毒性靶器官，提供無(wú)毒性反應(yīng)劑量，為臨床設(shè)計(jì)動(dòng)物用藥劑量和主要觀察指標(biāo)提供參考。

清瘟敗毒顆粒連續(xù)給藥42 d后，清瘟敗毒顆粒各劑量組的大鼠增重、攝食、血常規(guī)及血液生化值與對(duì)照組相比均未發(fā)生顯著性變化(P>0.05)；組織學(xué)觀察肝、腎、脾、胃腸、睪丸(♂)及卵巢(♀)等組織亦均未發(fā)現(xiàn)異常的組織病理學(xué)變化。

綜上所述，急性、亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明清瘟敗毒顆粒毒性很低或無(wú)毒性反應(yīng)。

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StudyontheAcuteandSub-chronicToxicityofQingwenBaiduGranules

GUO Shi-jin1,2，XU Qian-qian1,2，F(xiàn)U Shi-jun1,2，ZHOU Chun-feng1,2，WANG Yan-ping1,2，SHEN Zhi-qiang1,2*

(1.BinzhouAnimalScienceandVeterinaryMedicineAcademy,Binzhou,Shandong256600,China; 2.ShandongLvduAnteVeterinaryDrugCo.,Ltd.,Binzhou,Shandong256600,China;)

In the acute toxicity test,different concentrations of solution of Qingwen Baidu Granules were provided to the mice in the experimental group to determine the median lethal dose (LD50) and maximum tolerable dose (MTD); in the sub-chronic toxicity test,the rats in the experimental group were given solution of Qingwen Baidu Granules with 88,44 and 22 g/(kg·d) for consecutive 42 d,and the control group were fed physiologic saline,observing the growth,haematology,and blood biochemical indexes as well as the organ pathology of rats.The results show that the acute toxicity test failed to determine LD50; the MTD of mice was above 132 g/(kg·d);during the sub-chronic toxicity test,the rats of different groups had insignificant differences in body weight,Hematology indexes,blood biochemical indexes compared with the control.The acute toxicity test indicates that Qingwen Baidu Granules is not acutely toxic; while the sub-chronic toxicity shows that a consecutive oral dose is safer.

Qingwen Baidu granules; acute toxicity test; maximum tolerable dose (MTD); sub-chronic toxicity test

2013-01-14，修改回日期：2013-01-31

山東省技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目(20120916001)

郭時(shí)金(1974-)，男，四川內(nèi)江人，碩士，助理研究員，主要從事新獸藥的研發(fā)與應(yīng)用。E-mail: gsj7877@126.com

*[通訊作者]沈志強(qiáng)(1963-)，男，山東榮成人，研究員，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail: bzshenzq@163.com

S811.6

A

1005-5228(2014)01-0061-04