祖立闖，沈志強(qiáng)，＊，郭廣君，王金良，苗立中，董 林，呂素芳

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州256600）

豬偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起豬的一種急性、熱性傳染病，主要以發(fā)熱、腦脊髓炎、奇癢、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)障礙為主要特征，臨床上表現(xiàn)懷孕母豬流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎；新生仔豬發(fā)熱、神經(jīng)癥狀、麻痹、衰竭死亡，死亡率可達(dá)100%；成年豬多耐過而呈隱性感染，成為該病的主要傳染源［1－2］。該病在世界范圍內(nèi)流行，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3－5］，我國自1947年發(fā)現(xiàn)此病以來，現(xiàn)全國已有30多個省份發(fā)生流行，是嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一［6］。該病的危害在于病毒侵入豬體后，可潛伏于三叉神經(jīng)節(jié)或薦神經(jīng)節(jié)造成潛伏感染，病毒的潛伏感染使病豬終身帶毒并周期性向外排毒，給疾病的防治帶來很大困難［7］。

PRV屬皰疹病毒科（Herpesvifidae）a－皰疹病毒亞科（Alpha－h(huán)erpesvirinae），在生物型上屬于豬皰疹病毒I型（Suid herpesvirus－1，SHV－1）［8］。SHV－1基因大約編碼50種結(jié)構(gòu)蛋白，有11種為糖蛋白，其中g(shù)D是PRV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，它不但誘導(dǎo)體液免疫，而且誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，同時是病毒粒子表面的病毒感染細(xì)胞的主要分子，在病毒吸附和侵入宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，為病毒復(fù)制的必需基因，是一種重要的中和抗原，也是保護(hù)性抗體的主要目標(biāo)，能誘導(dǎo)較好的保護(hù)反應(yīng)，抵抗PRV強(qiáng)毒株攻擊［9－13］。因此gD被作為PRV特異性抗原研究的首選蛋白。本研究對gD基因進(jìn)行了截短表達(dá)，以表達(dá)的重組蛋白為包被抗原，優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件，建立了可檢測PR血清抗體的間接ELISA診斷方法，并對現(xiàn)地采集的豬血清進(jìn)行了檢測。

1 材料和方法

1.1 病毒株、細(xì)胞、菌株與血清

豬偽狂犬病毒SA株、倉鼠腎細(xì)胞BHK－21、克隆菌株 DH5α、表達(dá)菌株 BL21（DE3）、表達(dá)載體pET30a（＋）均由本實驗室保存。豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）陽性及陰性血清、豬瘟病毒（Classical Swine Fever virus，CSFV）、豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）、豬乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type，PCV－2）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎 病 毒 （Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）陽性血清均由本實驗室保存。IDEXX gDELISA試劑盒檢測為PR抗體陽性血清樣品102份及陰性的血清樣品共86份，由上海畜牧獸醫(yī)總站惠贈。臨床血清樣品共316份由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

Ex Taq酶、pMD18－T克隆載體、T4DNA連接酶及其它限制性內(nèi)切酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；低分子量蛋白Marker、TEMED購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；蛋白酶K、質(zhì)粒DNA提取試劑盒與膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌A蛋白（HRP－SPA）、TMB底物顯色液購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 病毒基因組DNA的提取

將PRV接種于BHK－21單層細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)典型病變后，收獲病毒，取病毒液535μL，加60 μL 10%SDS和5μL蛋白酶K（終濃度為200μg／mL），56℃水浴1h，分別用酚：氯仿：異戊醇、氯仿：異戊醇各抽提1次，上清加入異丙醇沉淀DNA，用75%乙醇洗滌2次，風(fēng)干后加60μL滅菌去離子水，測定純度及濃度后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank公布的PRV的SA毒株基因組序列（NC＿006151），利用oligo6.2軟件設(shè)計了擴(kuò)增gD基因的一對 引物，P1 5＇－ATAGGATCCGCGTACCCGTACACC GA－3＇；P2 5＇－ATTCAAGCTTC CCAGGAGGCGATACCC－3＇（劃線部分表示引入的BamH I、HindIII酶切位點），引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.5 gD基因的PCR擴(kuò)增與克隆

以提取的病毒基因組DNA為模板，用設(shè)計的引物PCR擴(kuò)增gD基因，PCR反應(yīng)條件為：95℃5 min預(yù)變性、95℃l min、60℃l min、72℃l min，共進(jìn)行30個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化后與pMD18－T載體于4℃過夜連接，轉(zhuǎn)化 DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，PCR及BamH I／HindIII雙酶切鑒定得到陽性重組質(zhì)粒pMD18－T－gD，送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行序列測定。

1.6 gD基因表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

利用BamH I／HindIII雙酶切pMD18－T－gD，回收目的片段，將其定向克隆到經(jīng)BamH I／Hind III雙酶切的pET30a表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，經(jīng)PCR及酶切鑒定后獲得重組表達(dá)載體pET30a－gD。鑒定陽性的克隆送生工生物工程（上海）有限公司測序，以驗證其閱讀框架。

1.7 pET30a－gD重組蛋白的表達(dá)與純化

將pET30a－gD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，采用不同誘導(dǎo)劑濃度、不同時間、不同溫度誘導(dǎo)pET30a－gD重組蛋白的表達(dá)，經(jīng)SDS－PAGE電泳分析，確定最佳誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度。以最佳條件誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲破碎細(xì)胞，12 000 r／min離心15min，分別收集上清及沉淀進(jìn)行SDSPAGE分析，鑒定目的蛋白是以可溶性形式存在于上清中還是以包涵體形式存在于沉淀中。對以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白用尿素對其進(jìn)行變性處理，包涵體溶解后采用鎳離子親和層析法純化，純化蛋白透析復(fù)性，進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析。

1.8 gD重組蛋白的western blot活性檢測

純化后的重組蛋白經(jīng)SDS－PAGE后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，加PRV陽性血清（1∶100稀釋）37℃作用1h，TBST緩沖液洗3次，加入兔抗豬IgG辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體（1∶5000稀釋）37℃作用50min，TBST緩沖液洗3次，在二氨基聯(lián)苯胺（DAB）緩沖溶液中顯色10min。

1.9 間接ELISA診斷方法的建立

1.9.1 PRV gD－PPA－ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化試驗

在相同的反應(yīng)條件下，分別將重組抗原以不同包被濃度與待檢樣品的不同稀釋倍數(shù)、不同封閉液與不同封閉時間、二抗不同稀釋倍數(shù)與不同作用時間組成方陣，經(jīng)方陣滴定試驗分別進(jìn)行各組份的條件優(yōu)化。原則是陽性血清 OD450nm≈1.0，陰性血清OD450nm＜0.2，選取P／N值最大的各個組合。在相同反應(yīng)條件下，與待檢樣品分別作用30min～120 min，底物分別顯色5min～20min，選擇陽性血清OD450nm≈1.0，陰性血清 OD450nm＜0.2，P／N值最大的一抗、底物作用時間。

1.9.2 PRV gD－PPA－ELISA判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定試驗判定標(biāo)準(zhǔn)采用Cut－Off值法，將經(jīng)中和試驗（NT）和IDEXX gD－ELISA試劑盒同時檢測為PRV抗體陰性的52份豬血清樣本，利用PRV gD－ELISA已優(yōu)化的最佳條件檢測，將OD450nm值轉(zhuǎn)換成S／P值，計算出52份血清的S／P平均值（ˉx）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），我們規(guī)定S／P（樣本）≥ˉx＋3SD時為陽性，S／P（樣本）＜ˉx＋2SD時為陰性，當(dāng)ˉx＋2SD≤S／P（樣本）＜ˉx＋3SD為可疑，需重新檢測樣本，重檢時S／P值≥ˉx＋2SD時判為陽性，S／P值＜ˉx＋2SD時為陰性。

1.9.3 特異性試驗 以建立的判斷標(biāo)準(zhǔn)與CSFV、PPV、PRRSV、JEV、PCV－2、PEDV、TGEV 陽性血清進(jìn)行PRV gD－PPA－ELISA檢測，同時設(shè)PRV標(biāo)準(zhǔn)陽、陰性血清對照，確定重組抗原與其它常見豬病陽性血清是否發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.9.4 敏感性試驗 將PRV標(biāo)準(zhǔn)陽性對照血清按1∶50～1∶25600倍稀釋，稀釋度平行做4個重復(fù)，用建立的 PRV gD－PPA－ELISA 檢測，測定OD450nm值，換算成S／P值，確定其抗體檢出效價。

1.9.5 重復(fù)性試驗 批內(nèi)重復(fù)性試驗，選取8份PR抗體水平不同的血清，在相同試驗條件下，每份血清樣本平行做8個重復(fù)，用PRV gD－PPA－ELISA檢測，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。批間重復(fù)性試驗，選取8份PR抗體水平不同的血清，在相同試驗條件下，在4個不同時間用PRV gD－PPA－ELISA檢測，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；在相同試驗條件下，用4批不同時間純化的重組抗原進(jìn)行PRV gDPPA－ELISA檢測，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.9.6 符合性試驗 IDEXX gD－ELISA試劑盒檢測結(jié)果為陽性和陰性的血清樣本，再用PRV gDPPA－ELISA檢測，以IDEXX試劑盒檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，計算PRV gD－PPA－ELISA相對于進(jìn)口試劑盒的符合率、敏感性、特異性。

1.1 0 應(yīng)用試驗

應(yīng)用本研究建立的PRV gD－PPA－ELISA抗體檢測方法檢測了來自山東、河南、河北等地的316份血清樣本，了解PRV血清抗體陽性率。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增、克隆及重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，在位于約1 070bp處可見特異性DNA擴(kuò)增帶（圖1），與預(yù)期大小相符。構(gòu)建的pMD18－T－gD質(zhì)粒經(jīng)PCR及BamH I／HindIII雙酶切鑒定后（圖2），測序結(jié)果表明克隆序列與毒株完全相同。構(gòu)建的pET30agD重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及BamH I／HindIII雙酶切鑒定后（圖3），測序結(jié)果表明其閱讀框正確。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Result of PCR Amplification

2.2 gD重組蛋白的表達(dá)與純化

圖2 重組質(zhì)粒pMD18－T－gD鑒定Fig.2 Identification of recombinant cloning vector

以最佳條件（誘導(dǎo)溫度為37℃、誘導(dǎo)劑濃度為1.0mmol／L、誘導(dǎo)時間為 5h）誘導(dǎo)表達(dá)，SDSPAGE表明所表達(dá)蛋白的分子量大小為50Ku，目的蛋白大部分是以包涵體形式表達(dá)的。包涵體經(jīng)8M尿素變性后，采用鎳離子親和層析法純化，純化后的蛋白透析復(fù)性，Bradford法測定蛋白濃度為0.56mg／mL（圖4）。

圖3 重組表達(dá)載體pET30a－gD鑒定Fig.3 Identification of recombinant expression vector

2.3 gD重組蛋白的western blot活性鑒定

純化后的蛋白經(jīng)SDS－PAGE后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，與PRV陽性血清作用，結(jié)果該重組蛋白能與PRV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而空載體表達(dá)菌與PRV陽性血清沒有反應(yīng)（圖5）。

2.4 PRV gD－PPA－ELISA相關(guān)條件確定試驗結(jié)果

2.4.1 PRV gD－PPA－ELISA 最佳反應(yīng)條件 由表1可知，重組抗原最佳包被濃度為5.6μg／mL；最佳封閉液為含1%BSA的PBST，最佳封閉時間為37℃作用2h；血清樣本最佳稀釋度為1∶100，最佳作用時間為37℃作用1h；二抗最佳工作濃度為1∶4000，最佳作用時間為37℃作用1h；底物最佳顯色時間為37℃作用10min。

圖4 重組蛋白的SDS－PAGE分析Fig.4 SDS－PAGE analysis of recombination protein

圖5 表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析Fig.5 Western blotting of expressed products 1.純

2.4.2 PRV gD－PPA－ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 52份陰性血清樣品，用PRV gD－PPA－ELISA檢測后，將血清樣本分成5組，以S／P值為橫坐標(biāo)，以各組樣品數(shù)量為縱坐標(biāo)，得到陰性血清樣品S／P數(shù)值分布直方圖（圖6），這些樣本的S／P值主要分布在0.05～0.20之間，占血清樣本的90.38%，數(shù)據(jù)分布合理，可以作為制定判定標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)。計算得出52份陰性血清S／P平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別為ˉx＝0.148與SD＝0.049。得出PRV gD－ELISA陰陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：即當(dāng)S／P（樣本）≥0.295時判為陽性；當(dāng)S／P（樣本）＜0.246時判為陰性；當(dāng)0.246≤S／P（樣本）＜0.295時判為可疑。對可疑樣本須重新檢測，重檢時，S／P（樣本）≥0.246為陽性。

表1 PRV gD－PPA－ELISA反應(yīng)條件試驗Table 1 Test of PRV gD－PPA－ELISA response conditions

2.5 特異性試驗結(jié)果

重組抗原與常見的CSFV、PPV、PRRSV、JEV、PCV－2、PEDV、TGEV 7種豬病陽性血清反應(yīng)的S／P值均低于0.246（見表2），呈陰性反應(yīng)。該結(jié)果表明重組蛋白與常見豬病的陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，顯示出了很好的特異性。

2.6 敏感性試驗結(jié)果

檢測PRV標(biāo)準(zhǔn)陽性對照血清，當(dāng)血清稀釋至1 2800倍時，檢測結(jié)果仍為陽性（圖7），證明所建立的方法具有較好的敏感性。

表2 交叉反應(yīng)試驗結(jié)果Table 2 Result of cross－reaction test

圖6 陰性血清樣品S／P值分布圖Fig.6 Distribution of S／P value of negative serum samples

2.7 重復(fù)性試驗結(jié)果

批內(nèi)重復(fù)性試驗變異系數(shù)小于5%（見表3），批間重復(fù)性試驗變異系數(shù)小于10%（見表4）。說明PRV gD－PPA－ELISA方法具有良好的重復(fù)性。

圖7 圖7PRV gD－PPA－ELISA敏感性試驗Fig.7 Sensitivity of PRV gD－PPA－ELISA

2.8 符合性試驗結(jié)果

IDEXX gD－ELISA試劑盒檢測結(jié)果為陽性的102份血清樣本，PRV gD－PPA－ELISA檢出陽性97份，陰性5份；IDEXX gD－ELISA試劑盒檢測結(jié)果為陰性的86份血清樣本，gD－PPA－ELISA檢出陰性76份，陽性10份。PRV gD－PPA－ELISA相對于進(jìn)口試劑盒的符合率為92.0%，敏感性為95.1%，特異性為88.1%。

表3 批內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果Table 3 Intro－batch repetition test

表4 批間重復(fù)性試驗結(jié)果Table 4 Inter－batch repetition test

表5 不同批次重組抗原批間重復(fù)性試驗結(jié)果Table 5 The recombinant antigens of inter－batch repetition test of different batches

表6 PRV gD－PPA－ELISA與IDEXX試劑盒相關(guān)性試驗結(jié)果Table 6 Comparison between gD－PPA－ELISA and IDEXX Kit for detecting field samples

2.9 現(xiàn)地應(yīng)用試驗結(jié)果

應(yīng)用本試驗研制的PRV gD－PPA－ELISA抗體檢測試劑盒檢測了來自山東、河南、河北等地的316份血清樣本，檢出陽性258份，陰性58份，血清抗體陽性率為81.6%。

3 討 論

目前，國內(nèi)外的PRV診斷試劑普遍使用全病毒、gE、gB及gD作為診斷抗原，全病毒抗原由于受病毒培養(yǎng)和純化等方面的技術(shù)限制，存在純度有限、穩(wěn)定性差、不易大批生產(chǎn)、容易散毒等缺點。gE是PRV的非必需蛋白，目前PRV疫苗多為gE基因缺失疫苗，用該蛋白作為血清學(xué)診斷抗原無法進(jìn)行疫苗免疫水平抗體監(jiān)測。gB蛋白是PRV蛋白中最保守的蛋白，該蛋白與皰疹病毒科其它皰疹病毒具有免疫交叉反應(yīng)。而gD糖蛋白是PRV成熟的病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也是PRV主要的免疫原性蛋白之一，它刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗gD的抗體具有中和保護(hù)能力，是制備血清學(xué)診斷抗原及亞單位疫苗的首選蛋白。表達(dá)外源蛋白的系統(tǒng)雖然較多，但大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉、表達(dá)量大、易于純化、易于工業(yè)化批量生產(chǎn)等優(yōu)點，是實驗室獲取重組蛋白的一種重要工具。由于pET30a原核表達(dá)載體所帶的融合標(biāo)簽小，重組蛋白折疊時不易掩蓋被研究蛋白的表位，能夠保持蛋白原有的反應(yīng)性。且pET30a原核表達(dá)載體的表達(dá)產(chǎn)物氨基端帶有6個his組氨酸融合標(biāo)簽，可以利用固定化金屬離子親和層析法純化，純化過程簡單，易于大量制備。因此本試驗利用pET30a原核表達(dá)載體，表達(dá)了PRVgD蛋白，經(jīng)免疫印跡試驗證實所截短表達(dá)的gD蛋白可與PRV陽性血清發(fā)生較強(qiáng)的反應(yīng)，說明重組gD蛋白具有良好的反應(yīng)性與特異性。豬偽狂犬的診斷方法較多，主要包括病毒的分離與鑒定、血清學(xué)及分子生物學(xué)檢測方法，其中血清學(xué)檢測方法是檢測PRV血清抗體的重要手段之一，在PRV的早期檢測、流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測等方面發(fā)揮著重要的作用，也是免疫豬群抗體水平監(jiān)測的主要方法。對于PRV的血清學(xué)診斷，OIE推薦使用病毒中和試驗，病毒中和試驗雖然準(zhǔn)確性高，但存在試驗周期長、操作繁瑣和不適于大批量樣品檢測等缺點。ELISA診斷方法具有敏感性和特異性強(qiáng)、操作簡單、檢測快速、高通量、無輻射、價格低廉等特點，是當(dāng)前動物傳染病檢疫、流行病學(xué)調(diào)查和免疫監(jiān)測廣泛采用的血清學(xué)診斷技術(shù)。本研究以原核表達(dá)的重組gD蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA診斷方法具有很好的敏感性和特異性，顯示出了良好的應(yīng)用前景。本實驗室預(yù)期將其組裝成試劑盒，為我國PRV疫苗免疫水平抗體監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查等提供一種簡便、快速的血清學(xué)檢測方法。

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