李 雯，羅 虹，柴志欣，鐘金城*

(1.云南省種畜繁育推廣中心冷凍精液站，昆明 云南 650212；2.動(dòng)物遺傳育種學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南民族大學(xué)，四川 成都 610041)

牦牛FSHR基因5′端部分序列克隆及生物信息學(xué)分析

李 雯1，羅 虹2，柴志欣2，鐘金城2*

(1.云南省種畜繁育推廣中心冷凍精液站，昆明 云南 650212；2.動(dòng)物遺傳育種學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南民族大學(xué)，四川 成都 610041)

利用PCR和T-A克隆技術(shù)，測(cè)定了麥洼牦牛和雜種犏牛的FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)和第1外顯子的核苷酸序列，并運(yùn)用BLAST、DNAMAN、Clustal等生物信息學(xué)軟件與其他物種的相應(yīng)序列進(jìn)行了同源性比對(duì)分析，為牦牛FSHR基因結(jié)構(gòu)、犏牛雄性不育、牦牛遺傳多樣性，以及FSHR基因與牦牛的繁殖、產(chǎn)肉、產(chǎn)奶性狀相關(guān)分析提供了理論基礎(chǔ)。結(jié)果表明：牦牛和犏牛FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)長度為970 bp，普通牛、羊和豬的該序列長度分別為970、973和981 bp，序列長度差異較??；序列突變以堿基替換為主，牦牛與犏牛、普通牛、羊及豬的核苷酸序列一致性分別為99.4%、99.3%、98.2%、96.9%，一致性較高，為同源基因。聚類分析中牦牛與犏牛首先相聚，再依次與普通牛、羊、豬聚在一起。根據(jù)核苷酸序列推測(cè)，氨基酸組成分析顯示，牦牛和犏牛的該蛋白疏水性，蛋白的親水性和穩(wěn)定性較差，為不穩(wěn)定的脂溶性蛋白；二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α螺旋和隨機(jī)卷曲為主。

牦牛；FSHR；基因克?。恍蛄蟹治?/p>

FSH是下丘腦分泌的一種多肽類物質(zhì)，是FSH/LH/細(xì)胞因子受體超家族成員之一，能促進(jìn)活化芳香化酶及誘導(dǎo)LH(促黃體素)受體的形成[1,2]。FSH能與FSHR結(jié)合，并由FSHR介導(dǎo)將信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)而產(chǎn)生一系列催化效應(yīng)及機(jī)體免疫應(yīng)答，從而對(duì)細(xì)胞代謝或功能活動(dòng)產(chǎn)生影響。鑒于FSHR基因?qū)Ψ敝承阅艿奶厥庹{(diào)節(jié)作用，作為侯選基因廣泛用于動(dòng)物繁殖育種研究中。目前，隨著動(dòng)物基因組計(jì)劃的開展和實(shí)施，功能基因的克隆測(cè)序和定位已成為動(dòng)物遺傳育種研究的熱點(diǎn)之一[3-6]。FSHR基因在羊、豬、普通牛等物種中研究較為廣泛[7-9]，劉永斌等[10]通過對(duì)巴美肉羊FSHR基因第10外顯子的PCR-SSCP多態(tài)性檢測(cè)來探討該基因?qū)Π兔廊庋蚍敝沉Φ挠绊?；陳洋等[11]利用VEGF對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞FSHR表達(dá)水平的分析中發(fā)現(xiàn)，生殖激素FSH在卵泡顆粒細(xì)胞的增殖和分化過程中起決定作用，且FSHR mRNA主要存在于各級(jí)時(shí)期的卵泡顆粒細(xì)胞中；吳井生等[12]研究發(fā)現(xiàn)FSHR基因第1外顯子的多態(tài)性對(duì)小梅山豬TNB和NBA具有顯著性影響。而在牦牛中研究較少，王明亮等[13]通過對(duì)牦牛FSHR基因5′端及第1外顯子的多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域存在9個(gè)突變位點(diǎn)，其部分基因型有縮短牦牛產(chǎn)犢間隔的趨勢(shì)。本研究對(duì)牦牛和犏牛FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)進(jìn)行T-A克隆測(cè)序，并與NCBI中普通牛、羊及豬等物種相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)分析，旨在為進(jìn)一步開展牦牛功能基因定位和分子育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

在麥洼牦牛和犏牛的主產(chǎn)區(qū)選取健康成年的牦牛個(gè)體為試驗(yàn)材料。頸靜脈采血(10 mL/頭)，EDTA抗凝帶回實(shí)驗(yàn)室， 20 ℃保存?zhèn)溆?。樣品采集地和?shù)量見表1。

1.2 基因組DNA提取及檢測(cè)

采用酚-氯仿法提取基因組DNA[10]，用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)雙重檢測(cè)DNA的純度和質(zhì)量濃度， 20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

綜合應(yīng)用primer 5.0、Oligo 6.0生物軟件對(duì)FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)部分片段設(shè)計(jì)引物。PF:5′-AATTCATTTGTGCCAGCATCC-3′;PR: 5′-AGTTCGACCGCATCCCTG-3′，覆蓋片段長度為970 bp。引物合成由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司完成。

PCR反應(yīng)體系為25 μL。其中，DNA模板5 μL(25 ng/μL)，上下游引物各5 μL (10 pmol/μL)，ddH2O 19.7 μL，Ex Taq 0.3 μL(5 U/μL)，10×Ex Taq Buffer(Mg2+free)5 μL，MgCl25 μL(25 mM)，dNTP Mixture 5 μL(25 mM)。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物、采樣地點(diǎn)及采樣地生態(tài)條件Table 1 Expermental animal,sampling place and ecological condition

PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性45 s，62.0 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 克隆測(cè)序

將回收純化的目的片段與pMD18-T載體充分混勻，在恒溫金屬浴中16 ℃連接2 h，將全量連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素、200 mg/mL IPTG 及20 mg/mL X-Gal 的LB平板，過夜培養(yǎng)。經(jīng)PCR篩選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.5 序列分析

測(cè)序結(jié)果用DNAMAN 、Version 5.2.10 Demo (Lynnon BioSoft)等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行拼接，對(duì)牦牛、犏牛、普通牛、羊、豬的FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列進(jìn)行比較分析，根據(jù)比對(duì)結(jié)果計(jì)算物種間核苷酸一致性比率。利用在線蛋白分析軟件(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)中ProtParam程序分析預(yù)測(cè)氨基酸的理化性質(zhì)(氨基酸的組成、相對(duì)分子生量、理論等電點(diǎn)、蛋白質(zhì)的親疏水性及穩(wěn)定性等)，SignalP 4.0 Server程序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列的信號(hào)肽，CDD分析軟件對(duì)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，牦牛及犏牛FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)PCR產(chǎn)物大小為約970 bp，擴(kuò)增片段與目的片段大小一致，且特異性好(圖1)。

2.2 重組子的測(cè)序

將PCR擴(kuò)增為陽性的克隆子，過夜培養(yǎng)，將菌液送到上?；倒具M(jìn)行測(cè)序。菌液PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果見圖2。

圖1 牦牛FSHR基因5'端的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR products of 5'of FSHR gene in Yak

圖2 菌液PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of a recombinant plasmid sample

2.3 FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)序列一致性分析

將克隆測(cè)序所得的牦牛及犏牛FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)序列與普通牛(GenBank Accession NO NW_001492929.1)、羊(GenBank Accession NO NW 001009289)和豬(GenBank Accession NO AF025377)的FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)，其中牦牛與犏牛一致性最高(99.4%)；與普通牛、羊和豬的序列一致性分別為99.3%、98.2%和96.9%(表2)。經(jīng)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，堿基變異類型主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)換和顛換，轉(zhuǎn)換的次數(shù)大于顛換的次數(shù)，存在插入和缺失現(xiàn)象。牦牛、犏牛及普通牛FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)核苷酸序列間堿基變異最少，遺傳距離最近，一致性最高，具有較高的序列保守性。牦牛、犏牛與普通牛FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)核苷酸序列高度同源，具體情況如下：麥洼牦牛與普通牛相比，發(fā)生1次缺失，6次堿基轉(zhuǎn)換和3次堿基顛換，85、210、962位堿基轉(zhuǎn)換(A←→G)，231、651、914位堿基轉(zhuǎn)換(T←→C)，271位堿基顛換(C←→A)，18、844位堿基顛換(T←→A)，132位發(fā)生堿基缺失；犏牛與普通牛相比，發(fā)生1次堿基插入、7次堿基轉(zhuǎn)換和7次堿基顛換，59、85、962位堿基轉(zhuǎn)換(A←→G)，231、657、820、914位堿基轉(zhuǎn)換(T←→C)，271、671、502位堿基顛換(C←→A)， 11位堿基顛換(T←→G)，18、460、485位堿基顛換(T←→A)，766位堿基插入。同時(shí)，在犏牛核苷酸序列第502位A←→C突變導(dǎo)致FSHR基因5′端啟動(dòng)子元件TATA盒發(fā)生突變。

表2 牦牛、犏牛和普通牛FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)序列間一致性Table 2 The homology of FSHR gene 5′flank region of yaks、pianniu and cattle %

2.4 FSHR基因的5′端側(cè)翼區(qū)SNP比較

不同物種間FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)的SNP位點(diǎn)數(shù)存在差異(表3)，共發(fā)現(xiàn)43個(gè)非同源性核苷酸位點(diǎn)，多態(tài)頻率變化范圍在0.007～0.034之間。含2個(gè)單堿基變異多態(tài)位點(diǎn)的共有5處，分別為232、392、452、582、744位點(diǎn)。

表3 不同物種間FSHR基因的5′端側(cè)翼區(qū)序列SNP比較Table 3 FSHR gene 5′flank region of SNP comparison results

2.5 FSHR蛋白質(zhì)的氨基酸分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

預(yù)測(cè)麥洼牦牛和犏牛FSHR蛋白分子量分別為80518.1 Da、80715.4 Da，等電點(diǎn)均為PI=5.05，其不穩(wěn)定指數(shù)分別為51.86、52.74，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂質(zhì)指數(shù)分別為27.55和27.53，Hydropathicity (GRAVY)分別為0.875、0.885(Hydropathicity>0，疏水；Hydropathicity<0親水)，顯示該蛋白為疏水性結(jié)構(gòu)蛋白。牦牛和犏牛FSHR蛋白均不存在信號(hào)肽。

通過CpG島在線分析軟件發(fā)現(xiàn)，牦牛和犏牛FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)序列中并不存在CpG島。利用NCBI在線CDD分析軟件對(duì)牦牛和犏牛FSHR蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。由圖3可知，牦牛和犏牛FSHR蛋白在其N端均含有一個(gè)亮氨酸富集重復(fù)結(jié)構(gòu)域，在該區(qū)域短的序列片段中存在一些具有多樣化功能和細(xì)胞定位的蛋白質(zhì)，通常存在于半胱氨酸域的兩側(cè)。

圖3 牦牛和犏牛FSHR蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Conserved domain of protein about FSHR

利用在線分析軟件ExPASy中SOPMA程序進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。該蛋白主要由α螺旋(Alpha helix)、延伸鏈(Extended strand)、β轉(zhuǎn)角(Beta turn)、隨機(jī)卷曲(Random coil)組成(圖4)。其中主要為α螺旋和隨機(jī)卷曲，其他含量均較少。

通過工具PSORTⅡ預(yù)測(cè)FSHR編碼產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位，其分布在質(zhì)膜的可能性是56.5%，分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的可能性為34.8%，在空泡和高爾基體中也有少量分布均為4.3%。因此可以推斷，牦牛和犏牛FSHR 編碼產(chǎn)物可能主要在質(zhì)膜中發(fā)揮生物學(xué)功能。

圖5 牦牛和犏牛FSHR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Secondary structure prediction of FSHR protein

3 討 論

FSHR屬于糖蛋白激素家族，調(diào)控促卵泡激素(FSH)的分泌和表達(dá)，在繁殖過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。在哺乳動(dòng)物中FSHR基因是被深入廣泛研究的基因域，其基因組具有較豐富的遺傳多態(tài)性，且目前的研究主要集中在FSHR基因5′調(diào)控區(qū)及第10外顯子。許艷麗等[15]研究發(fā)現(xiàn)牛FSHR基因外顯子4與綿羊該序列同源性達(dá)到100%，與大鼠同源性最低83%。王明亮等[16]通過對(duì)黃牛FSHR基因的理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因較為保守。魏伍川等[17]通過對(duì)西門塔爾牛FSHR基因5′側(cè)翼序列的多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)存在TapⅠ酶切多態(tài)性，該基因與牛的繁殖性狀存在連鎖相關(guān)。魏伍川等[18]研究還發(fā)現(xiàn)牦牛FSHR基因第10外顯子存在2處錯(cuò)義突變。

本研究通過對(duì)牦牛及犏牛FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)序列的克隆分析，表明牦牛和犏牛FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)長度為970 bp，普通牛、羊和豬的該序列長度分別為970、973和981 bp，說明幾個(gè)種群的序列長度差異較小。共發(fā)現(xiàn)43個(gè)非同源性核苷酸位點(diǎn)，多態(tài)頻率變化范圍在0.007～0.034之間，序列突變以堿基替換為主，堿基的插入缺失會(huì)導(dǎo)致DNA構(gòu)象的改變，影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，這些突變位點(diǎn)是否與FSHR基因的繁殖性能相關(guān)，還有待驗(yàn)證。通過分析FSHR的編碼產(chǎn)物，推測(cè)出FSHR蛋白由323個(gè)氨基酸組成，牦牛和犏牛所測(cè)多肽鏈表現(xiàn)為疏水性，說明該蛋白的親水性和穩(wěn)定性較差，為不穩(wěn)定的脂溶性蛋白，這與王明亮等[19]研究結(jié)果一致。FSHR編碼產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α螺旋和隨機(jī)卷曲為主，主要在質(zhì)膜中發(fā)揮生物學(xué)作用。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該編碼產(chǎn)物含有亮氨酸富集重復(fù)結(jié)構(gòu)域，具有細(xì)胞定位等多樣化的功能。通過序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，犏牛核苷酸序列第502位A←→C的顛換突變較為明顯，導(dǎo)致FSHR基因5′端啟動(dòng)子元件TATA盒發(fā)生突變，這與牛金濤等[20]研究發(fā)現(xiàn)水牛FSHR基因5′端啟動(dòng)子區(qū)中存在TATA盒基元的結(jié)果一致，且在水牛、山羊和牛之間沒有堿基差異，說明啟動(dòng)子區(qū)域在不同物種間高度同源并發(fā)揮相同的調(diào)節(jié)功能。因此，F(xiàn)SHR基因的表達(dá)調(diào)控可能是造成牦牛、犏牛、普通牛、羊及豬個(gè)體繁殖性狀差異的原因之一。

通過對(duì)FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)序列同源性比較可知，牦牛與犏牛、普通牛、羊及豬之間該基因一致性極高，在所擴(kuò)增的970 bp片段中，僅有7、7、29和46位點(diǎn)不同，核酸變異率為0.6%、0.7%、1.8%和3.1%。這一結(jié)果與已報(bào)道的牦牛的GH基因、FSH基因和LH基因的研究結(jié)果相似，暗示了牦牛與犏牛和普通牛之間功能基因的堿基序列一致性高，同一種屬內(nèi)保守性極強(qiáng)；而與羊及豬之間序列差異較大，有較多插入和缺失發(fā)生，該基因片段具有種間差異性。因此，在不同的牛種之間可開展比較遺傳學(xué)研究，利用普通牛中已定位和克隆的主基因(QTL)或DNA標(biāo)記來分析研究牦牛主要繁殖性狀的主基因，并定位于牦牛染色體上，進(jìn)而加快牦牛功能基因組研究和主基因定位的速度。通過對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，牦牛和犏牛FSHR基因及其編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)、序列特征、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能預(yù)測(cè)與其他哺乳動(dòng)物FSHR相關(guān)結(jié)構(gòu)功能極為相似，說明FSHR基因及其編碼產(chǎn)物具有較強(qiáng)的相似性。牦牛和犏牛FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)序列中并不存在CpG島。通常蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)中包含著許多功能結(jié)構(gòu)域，不同的功能結(jié)構(gòu)域各司其職決定著該蛋白特殊功能。通過對(duì)保守功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)，推測(cè)出蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。

4 結(jié) 論

牦牛和犏牛FSHR基因5′端側(cè)翼區(qū)序列與普通牛、羊和豬該序列長度差異較小，一致性較高，為同源序列，突變以堿基替換為主。牦牛和犏牛的FSHR蛋白疏水性、蛋白的親水性和穩(wěn)定性較差，為不穩(wěn)定的脂溶性蛋白；二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α螺旋和隨機(jī)卷曲為主。

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CloningandSequenceAnalysisof5'FlankRegionofFSHRGeneinYak

LI Wen1,LUO Hong2,CHAI Zhi-xin2,ZHONG Jin-cheng2*

(1.StationofFrozensemen,YunnanExtensionCenterforAnimalBreeding,Kunming,Yunnan650212,China；2.KeyLaboratoryofAnimalGeneticsandBreeding,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan610041,China)

The complete sequences of FSHR 5′flank region (5′flank region and exonⅠ) of Maiwa yaks and Pianniu were determined by PCR (polymerase chain reaction) method and the T-A clone method,then the homologous analysis of the complete sequences of the FSHR 5′flank region between Maiwa yaks and Pianniu and other species was conducted through bioinformatics softwares such as BLAST,DNAMAN,Clustal,etc.,hoping to provide theoretical support for the future researches and studies on the gene structure of FSHR,Dzo male sterility,Yak genetic diversity,and correlation analysis on FSHR Gene and the breeding,meat production,and milk production traits of yaks.The research results showed that FSHR 5′flank region sequence length is 970 bp,and those of cattle,sheep and pigs are 970,973 and 981 bp,only with slight difference in between.Sequence mutation was mainly in the form of base substitution; the nucleoside sequences homology of yak,pianniu,cattle,sheep and pig are 99.4%,99.3%,98.2%,96.9% respectively.Yak has the closest relationship with pianniu followed by cattle,sheep,and then pig.According to the analysis of amino acid components predicted by the nucleoside sequence,FSHR protein in Yak and Pianniu is unstable,having poor hydrophobicity,hydrophilicity,and stability,and its secondary structure is mainly helix and randomly coiled.

yak; FSHR; cloning; sequence analysis

2013-10-04，

2013-11-05

國家科技支撐計(jì)劃課題(2012BAD13B06)；中央高?？蒲袑ｍ?xiàng)基金項(xiàng)目(No．11NZYTH03)

李 雯(1968-)，女，云南德宏人，畜牧師，主要從事畜牧技術(shù)推廣和凍精生產(chǎn)管理工作。E-mail：yngdwen@163.com

*[通訊作者]鐘金城(1963-)，男，云南綠春人，博士，教授，主要研究方向：動(dòng)物遺傳學(xué)。E-mail：zhongjincheng518@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)01-0015-06