劉素平

·臨床研究·

室溫測定凝血酶原時間及國際標(biāo)準(zhǔn)化比率方法學(xué)研究

劉素平

凝血酶原時間；標(biāo)準(zhǔn)化

凝血酶原時間(PT)是臨床常用的測定外源性凝血因子的過篩實驗，具有敏感、快速的優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于多種疾病的診斷和治療[1]，PT檢測方法主要包括Owren法與Quick法兩種。我國多數(shù)實驗室采用Quick法檢測PT。目前，Quick法檢測PT一般采用濕化學(xué)法，即將液體凝血活酶及CaCl2與標(biāo)本混合，37℃條件下記錄凝固時間。這需要恒溫裝置將反應(yīng)體系溫度穩(wěn)定在37℃，而且儀器開機(jī)后需要一定的預(yù)溫時間才能進(jìn)行標(biāo)本的檢測。該方法與干化學(xué)法相比未不夠簡便、快速，不能滿足床旁檢驗的需求。為了使各種不同的凝血活酶試劑測定相同標(biāo)本得出的PT結(jié)果具有可比性，國際血栓與止血委員會(ICTH)與國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(ICSH)推薦將國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(international normalized ratio，INR)作為PT的報告方式[2，3]。本研究旨在建立室溫下檢測INR的濕化學(xué)方法，為濕化學(xué)法INR床旁檢驗方法的建立提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取2006年10月至2007年4月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院住院及門診患者44例，分為正常對照組及華法林抗凝治療組2組，正常對照組包括正常體檢者20例，其中男13例，女7例；年齡(46±16)歲。華法林抗凝治療組包括口服華法林抗凝治療兩周以上患者22例，其中男12例，女10例；年齡(42±9)歲。

1.2 儀器與試劑 美國Pacific Hemostasis公司生產(chǎn)凝血質(zhì)控品(level1，lever2)；美國Instrument Laboratory 公司生產(chǎn)凝血酶原時間檢測試劑；美國Instrument Laboratory 公司生產(chǎn)ACL9000全自動凝血分析儀。

1.3 方法 抽取正常體檢者及華法林抗凝治療患者靜脈血2.7 ml，109 mmol/L枸掾酸鈉1∶9抗凝，3000 r/min離心15 min，分離血漿，-20℃保存?zhèn)溆?。按《全國臨床檢驗操作規(guī)程(第3版)》推薦方法分別測定兩質(zhì)控品在18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、37℃、39℃、41℃條件下凝血酶原時間。根據(jù)兩質(zhì)控品耙值(INRlevel 1∶1.03，INRlevel 2∶1.89)及不同溫度下兩質(zhì)控品PT值，由下式計算出不通溫度下正常對照凝血時間(NCT)及試劑ISI值。以溫度(t)為自變量，分別以NCT、ISI為因變量，采用曲線估計方法建立回歸方程。室溫(24.5℃)條件下按《全國臨床檢驗操作規(guī)程(第3版)》推薦方法分別測定正常對照組及華法林抗凝治療組凝血酶原時間，根據(jù)3.3得到的回歸方程計算出INR值,以溫度(t)為自變量，NCT為因變量，采用曲線估計方法建立回歸方程如下。NCT=71.4462-3.2239t+0.447t2。以溫度(t)為自變量，ISI為因變量，采用曲線估計方法建立回歸方程如下。ISI=2.164+0.0033t-0.0007t2。ACL9000全自動凝血分析儀檢測37℃條件下正常對照組及華法林抗凝治療組INR值，采用配對t檢驗方法比較兩種方法得到INR值的差別。采用Pearson相關(guān)分析法計算兩種方法得到INR值的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度下測定兩質(zhì)控品PT及計算得到NCT、ISI值 見表1。

表1 不同溫度下測定兩質(zhì)控品PT及NCT、ISI值

2.2 2組室溫(24.5℃)及37℃條件下INR值 室溫(24.5℃)及37℃條件下測定正常對照組及華法林抗凝治療組INR值結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2室溫(24.5℃)及37℃條件下正常對照組及
華法林抗凝治療組INR值

組別PT室溫(s)PT37℃(s)INR室溫INR37℃正常對照組(n=20)22.79±2.0113.29±1.201.06±0.141.09±0.14抗凝治療組(n=22)34.16±8.7619.87±5.111.91±0.701.93±0.69

3 討論

1910年Duke首先使用出血時間(BT)檢測機(jī)體凝血功能，開創(chuàng)了凝血檢測的先河。Quick、Proctor和Rapaport分別于1930年和1960年報道了經(jīng)典的外源和內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的過篩試驗PT和活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time ，APTT)。1950年Schnitger和Cross率先推出四通道自動凝血分析儀,該儀器采用凝固法分析原理,通過檢測血漿標(biāo)本在凝固過程中電流的變化來判斷凝固點(diǎn)[4]。20世紀(jì)70年代,隨著臨床化學(xué)、生物技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，自動凝血分析技術(shù)發(fā)展迅速。目前,自動凝血分析儀已發(fā)展到第3代產(chǎn)品[5]。其的特點(diǎn)是自動化程度高,可快速定量分析止血與血栓系統(tǒng)的多種成分,已接近全自動臨床化學(xué)分析儀的水平,如MDA-180凝血分析儀(1991年)及隨后的CA6000凝血分析儀等。自動凝血儀發(fā)展的另一趨勢是床旁凝血儀的不斷出現(xiàn),尤其適應(yīng)于床床旁監(jiān)測[6]。

凝血酶原時間(PT)是當(dāng)前監(jiān)測口服抗凝藥物效果的主要試驗指標(biāo)，長期以來，PT得報告方式多種多樣。如報告時間(秒)、百分活度、比率和PT指數(shù)等。由于PT檢測結(jié)果受試劑來源不同、檢測儀器和操作技術(shù)等多種因素影響，其結(jié)果可能差異較大[7]，為解決此問題，WHO于1979至1983年提出用參比凝血活酶校正市售凝血活酶，計算得到國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)作為標(biāo)準(zhǔn)化PT的報告方式，其公式為：其中NCT為正常對照均值PT。ISI為國際敏感指數(shù)，ISI是凝血活酶試劑與國際參比凝血活酶比較的敏感度。INR作為標(biāo)準(zhǔn)化報告方式在口服抗凝藥物的治療監(jiān)測方面取得了巨大的進(jìn)展，大大提高了長期用藥的安全性[8]，目前INR系統(tǒng)在我國已經(jīng)被廣泛接受。

目前，床旁凝血儀已開始在臨床應(yīng)用，INR的床旁分析具有快速、簡便、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn),能提供較準(zhǔn)確的過篩數(shù)據(jù),而且大大節(jié)約了完成試驗所需的時間,尤其適應(yīng)于抗凝和溶栓治療的床旁監(jiān)測[9]?，F(xiàn)在床旁凝血儀主要利用干化學(xué)技術(shù)進(jìn)行PT及INR的檢測。其原理是用惰性順磁鐵氧化顆粒(PIOP)結(jié)合于可產(chǎn)生纖溶或凝固反應(yīng)的干試劑中。PIOP可在固定垂直磁場作用下移動。當(dāng)血標(biāo)本通過毛細(xì)管作用進(jìn)入反應(yīng)層后,將干試劑溶解,并發(fā)生相應(yīng)的纖溶或凝固反應(yīng),與試劑結(jié)合的PIOP在反應(yīng)過程中其移動或擺動幅度的大小發(fā)生改變，從而提供纖維蛋白溶解或形成的動力學(xué)特征。光電檢測器可記錄PIOP擺動所產(chǎn)生的光度變化。信號經(jīng)放大、轉(zhuǎn)換、計算而得到PT及INR檢測結(jié)果[10]。該方法由于檢測成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于濕化學(xué)法，因而在臨床應(yīng)用上受到一定限制。目前尚無利用濕化學(xué)法進(jìn)行PT/INR床旁檢驗的儀器。本研究表明，利用溫度(t)于NCT及ISI的回歸方程可計算出室溫條件下(18～41℃)任意溫度的INR值。通過該方法室溫下測定正常人INR值與37℃條件下INR測定值無顯著性差異，且具有很好的相關(guān)性(P=0.999)。對于華法林抗凝治療患者，室溫下INR值與37℃條件下INR測定值也具有很好的相關(guān)性，表明該方法同樣適用于華法林抗凝效果監(jiān)測。

隨著電子計算機(jī)技術(shù)及生物技術(shù)的飛速發(fā)展，凝血檢測正向著兩個方向發(fā)展，一是高度自動化、智能化的全自動凝血分析，一類是微量、快速、簡便的床旁凝血分析。但由于干化學(xué)法床旁凝血分析儀受本身檢測原理的限制，檢測成本較高，未能在各級醫(yī)療單位普及使用。本研究結(jié)果表明室溫下利用濕化學(xué)法檢測PT/INR具有與全自動凝血分析儀一致的結(jié)果，是檢測外源性凝血系統(tǒng)異常及華法林抗凝效果檢測的一種可靠方法，為濕化學(xué)法PT/INR床旁檢測提供了理論及試驗基礎(chǔ)。

1 胡蓉,劉春棋,江麗霞,等.凝血酶原時間測定標(biāo)準(zhǔn)化的幾點(diǎn)探討.江西醫(yī)學(xué)檢驗雜志,2001,19:71-72.

2 Murray ET,Fitzmaurice DA,McCahon D.Point of care testing for INR monitoring:where are we now.Br J Haematol，2004，127:373-378.

3 Riley RS,Rowe D,Fisher LM.Clinical utilization of the international normalized ratio (INR).J Clin Lab Anal，2000，14:101-114.

4 Hein SM,Reinauer H.Automationincoagulationtesting.JIFCC,1996,8:117.

5 Mohammed A,Mehrabani PA,Coombs R,et al.The MDA-18 coagulation analyzer:alaboratoryevaluation Pathology，1997,29:176.

6 程貴法.凝血分析儀的原理發(fā)展及結(jié)果影響分析.醫(yī)學(xué)影像與檢驗，2011,24：317-318.

7 李芒會，李亞娥.不同分析原理的凝血儀檢測PT和INR值的研究.現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012,27：73-75.

8 關(guān)明.凝血酶原時間測定的INR的若干問題.上海醫(yī)學(xué)檢驗雜志，1998，13:340-341.

9 韓俊麗，田紅燕，吉亞紅，等.便攜式血凝儀在抗凝治療監(jiān)測中的應(yīng)用.臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2012,11：1779-1782.

10 田寧，黃山，張健.自動凝血分析方法與技術(shù)的進(jìn)展.安徽醫(yī)藥，2001，5:288-289.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.13.044

065000 河北省廊坊市中醫(yī)院

R 446

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1002-7386(2014)13-2023-02

2014-01-21)