問明 馬振峰 張卓奇 崔乃鵬 溫軍業(yè)

·論著·

環(huán)磷酰胺對腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)作用的研究

問明 馬振峰 張卓奇 崔乃鵬 溫軍業(yè)

目的觀察環(huán)磷酰胺(CTX)對黑色素瘤小鼠動物模型腫瘤微環(huán)境的干預(yù)及抗瘤作用。方法應(yīng)用黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞株皮下接種制備荷黑色素瘤的小鼠動物模型。將不同劑量的CTX分別對不同組的小鼠模型進(jìn)行腹腔注射，流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾淋巴懸液中中Treg 的含量，篩選CTX最佳劑量。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測最佳劑量CTX腹腔注射后Treg水平的動態(tài)變化。應(yīng)用 ELISA 法檢測小鼠血清中IL-10、TGF-β水平的動態(tài)變化。定期測量腫瘤大小繪制出腫瘤的生長曲線。結(jié)果CTX腹腔注射的最佳劑量為100 mg/kg，腹腔注射CTX后Treg水平及IL-10、TGF-β水平均出現(xiàn)下降后再緩慢升高的波動趨勢，低劑量CTX腹腔注射后不影響腫瘤的生長。結(jié)論低劑量CTX腹腔注射可以有效的調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，同時(shí)不影響荷瘤小鼠腫瘤的生長。

CTX；黑色素瘤；腫瘤微環(huán)境；Treg；IL-10；TGF-β

惡性腫瘤來源于機(jī)體正常細(xì)胞的突變，其發(fā)生與發(fā)展同宿主的機(jī)體免疫功能關(guān)系密切。機(jī)體通過免疫系統(tǒng)的免疫監(jiān)視功能，針對突變的細(xì)胞產(chǎn)生一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對突變細(xì)胞的清除。然而在機(jī)體腫瘤發(fā)生及發(fā)展的過程中，體內(nèi)腫瘤的微環(huán)境隨之發(fā)生改變，進(jìn)而維持腫瘤組織能夠進(jìn)一步生長[1,2]。存在于腫瘤微環(huán)境中的各種免疫抑制性細(xì)胞及抑制性細(xì)胞因子造就了腫瘤病變局部的免疫抑制性微環(huán)境，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移侵襲等方面發(fā)揮著重要作用。其中Treg細(xì)胞是腫瘤患者機(jī)體微環(huán)境中引起腫瘤免疫耐受的主要因素之一。同時(shí)IL-10、TGF-β1、VEGF 等細(xì)胞因子，可以擴(kuò)增胸腺來源的天然 Treg并可誘導(dǎo)產(chǎn)生出更多的Treg細(xì)胞。研究顯示腫瘤患者的Treg比例顯著升高，與預(yù)后呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系[3]。Treg細(xì)胞在T細(xì)胞中的比例可以反映出腫瘤微環(huán)境的變化狀態(tài)。因此，對于Treg 水平進(jìn)行調(diào)控成為目前腫瘤微環(huán)境干擾的研究熱點(diǎn)。本研究通過觀察低劑量CTX 對荷瘤小鼠 Treg細(xì)胞水平的影響探尋CTX應(yīng)用的最佳劑量，并觀察CTX對Treg水平及IL-10、TGF-β1水平的調(diào)控的動態(tài)變化情況，來評判CTX對于腫瘤微環(huán)境的干擾能力，為腫瘤免疫治療研究提供更為詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與腫瘤細(xì)胞株 健康的雌性C57BL/6小鼠，6～8周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證編號：SCXK 京 2009-0004)。黑色素瘤細(xì)胞B16F10細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 主要試劑及儀器 小鼠調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞流式檢測試劑盒美國eBioscience 公司，注射用 CTX 購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(批號：08012021)；RPMI1640 培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；胎牛血清(FCS)購自杭州四季青生物工程材料有限公司，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)Elisa kit、白介素10(IL-10)Elisa kit 美國R&D Systems公司，流式細(xì)胞儀美國Beckman Coulter公司，酶標(biāo)儀美國 Thermo Electron公司

1.3 黑色素瘤荷瘤小鼠模型的建立 取對數(shù)生長期的黑色素瘤細(xì)胞，使用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，調(diào)整濃度至 1×106/ml，取瘤細(xì)胞混懸液 0.2 ml(含2×105個(gè)細(xì)胞)接種于小鼠背部皮下，觀察小鼠局部注射區(qū)域出現(xiàn)腫瘤即成功建立黑色素瘤荷瘤小鼠模型。

1.5 環(huán)磷酰胺(CTX)腹腔注射后Treg水平及IL-10、TGF-β水平的動態(tài)變化 選取荷瘤成功小鼠，隨機(jī)分為2組，A組荷瘤小鼠給予CTX腹腔注入(應(yīng)用最佳劑量)(其中A1組小鼠定期處死用于Treg及血清IL-10、TGF-β水平檢測，A2組小鼠用于繪制生存曲線)，B組荷瘤小鼠給予等體積生理鹽水腹腔注射作為對照組(其中B1組小鼠定期處死用于Treg及血清IL-10、TGF-β水平檢測，B2組小鼠用于繪制生存曲線)。分別于環(huán)磷酰胺注射前d0、注射后d1，d4，d7，d11和d15取A1及B1組相應(yīng)小鼠各5只，摘眼球取外周血留取血清備ELISA檢測，隨后脫頸處死小鼠剖腹取出脾臟，制備脾細(xì)胞懸液流式檢查Treg水平。腹腔注射CTX組及對照組小鼠均每2天使用游標(biāo)卡尺測量小鼠體表瘤體的長徑(a)和短徑(b)，按照公式V=1/6π(ab2)計(jì)算腫瘤體積，進(jìn)而繪制腫瘤生長曲線，對比CTX注射組及NS注射組腫瘤生長情況的差異。

2 結(jié)果

表1不同劑量CTX注射組荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液中Treg/CD4+的比例

組別Treg/CD+40mg/kg組25.78±0.9150mg/kg組15.07±1.12100mg/kg組4.56±1.05200mg/kg組10.93±1.75

2.2 環(huán)磷酰胺(CTX)腹腔注射后Treg水平及IL-10、TGF-β水平的動態(tài)變化

2.2.1 CTX腹腔注射對荷瘤小鼠Treg 細(xì)胞水平的影響：流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果顯示，與CTX腹腔注射前相比，CTX腹腔注射后荷瘤小鼠脾臟中Treg 細(xì)胞比例明顯下降，并于注射后第4天降至最低水平。見圖1。

圖1 CTX腹腔注射后Treg水平的動態(tài)變化

2.2.2 CTX腹腔注射對荷瘤小鼠血清 IL-10 水平的影響：經(jīng)ELISA 檢測，結(jié)果顯示，小鼠血清 IL-10 水平隨荷瘤出現(xiàn)升高，CTX腹腔注射后，荷瘤小鼠模型血清中 IL-10水平較注射前出現(xiàn)下降，于注射后第4天水平降至最低水平。見圖2。

2.2.3 CTX腹腔注射對荷瘤小鼠血清TGF-β 水平的影響：經(jīng)ELISA 檢測，結(jié)果顯示，小鼠血清TGF-β 水平隨荷瘤出現(xiàn)升高，CTX腹腔注射后，荷瘤小鼠模型血清中TGF-β水平較注射前出現(xiàn)下降，于注射后第7天水平降至最低水平。見圖3。

2.3 CTX腹腔注射對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響 給予CTX腹腔注射后檢測腫瘤生長情況，繪制腫瘤體積變化曲線，與對照組比較，腫瘤體積變化無明顯差異。見圖4。

3 討論

圖2 CTX腹腔注射后IL-10水平的動態(tài)變化

圖3 CTX腹腔注射后TGF-β水平的動態(tài)變化

圖4 CTX腹腔注射后對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

我們繼續(xù)應(yīng)用100 mg/kg CTX對荷瘤小鼠進(jìn)行腹腔注射，進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過注射后小鼠脾臟中Treg 細(xì)胞比例及血清中IL-10、TGF-β水平下降，且對于腫瘤微環(huán)境中免疫抑制因素的下調(diào)作用可以持續(xù)一定時(shí)間，有利于增強(qiáng)移植物的抗腫瘤效應(yīng)(graft-versus-tumor effect)的發(fā)揮，同時(shí)與對照組對比發(fā)現(xiàn)，依照100 mg/kg給予CTX腹腔注射對于荷瘤小鼠腫瘤生長未見明顯影響，提示100 mg/kg的CTX干擾微環(huán)境作為過繼性回輸?shù)念A(yù)處理，在改善腫瘤局部微環(huán)境的同時(shí)并不會對效應(yīng)細(xì)胞療效的評價(jià)產(chǎn)生影響。

總之，本研究提示低劑量CTX腹腔注射可以有效的調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，同時(shí)不影響荷瘤小鼠腫瘤的生長，為腫瘤免疫治療相關(guān)研究中CTX在腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)中的應(yīng)用提供了更為詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 Dougherty GJ,Dougherty ST.Exploiting the tumor microenvironment in the development of targeted cancer gene therapy.Cancer Gene therapy,2009,16:279-290.

2 Pang YL,Zhang HG,Peng JR et al.The immunosuppressive tumor microenvironment in hepatocellular carcinoma.Cancer Immunol Immunother,2009,58:877-886.

3 Curiel TJ.Tregs and rethinking cancer immunotherapy.J Clin Invest,2007,117:1167-1174.

4 Lutsiak MEC,Semnani RT,De Pascalis R,et al.Inhibition of CD4+CD25+ T regulatory cell function implicated in enhanced immune response by low-dose cyclophosphamide.Blood,2005,105:2862-2868.

5 Lord EM,Penney DP,Sutherland RM,et al.Morphological and functional characteristics of cells infiltrating and destroying tumor multicellular spheroids in vivo.Virchows Archiv,1979,31:103-116.

6 Naumov GN,Folkman J,Straume O.Tumor dormancy due to failure of angiogenesis:role of the microenvironment.Clinical & experimental metastasis,2009,26:51-60.

7 Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.J Immunol,1995,155:1151-1164.

8 Schabowsky RH,Madireddi S,Sharma R,et al.Targeting CD4+CD25 +FoxP3 + regulatory T-cells for the augmentation of cancer immunotherapy.Curr Opin Investig Drugs,2007,8:1002-1008.

9 Burocchi A,Pittoni P,Gorzanelli A,et al.Intratumor OX40 stimulation inhibits IRF1 expression and IL-10 production by Treg cells while enhancing CD40L expression by effector memory T cells.European journal of immunology,2011,41:3615-3626.

10 D’Alise AM,Ergun A,Hill JA,et al.A cluster of coregulated genes determines TGF-beta-induced regulatory T-cell (Treg) dysfunction in NOD mice.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2010,108:8737-8742.

11 Lundqvist A,Mc Coy JP,Samsel L,et al.Reduction of GVHD and enhanced antitumor effects after adoptive infusion of alloreactive Ly49-mismatched NK cells from MHC-matched donors.Blood,2007,109:3603-3606.

12 Hatiboglu MA,Kong LY,Wei J,et al.The tumor microenvironment expression of p-STAT3 influences the efficacy of cyclophosphamide with WP1066 in murine melanoma models.International Journal of Cancer,2012,131:8-17.

13 Motoyoshi Y,Kaminoda K,Saitoh O,et al.Different mechanisms for anti-tumor effects of low-and high-dose cyclophosphamide.Oncol Rep,2006,16:141-146.

14 Matsushita N,Pilon-Thomas SA,Martin LM,et al.Comparativemethodologies of regulatory T cell depletion in a murine melanoma model.J Immunol Methods,2008,333:167-179.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.13.007

071000 河北省保定市，河北大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科(問明、馬振峰、張卓奇、崔乃鵬);河北省人民醫(yī)院外科(溫軍業(yè))

R 979.1

A

1002-7386(2014)13-1942-04

2014-02-20)