馬小剛 楊曉光 趙崢

·論著·

肺癌組織Lipocalin-2表達(dá)與肺癌預(yù)后的關(guān)系

馬小剛 楊曉光 趙崢

目的探討肺癌組織脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2(Lipocalin-2)表達(dá)與基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)Lipocalin-2、MMP-9在55例肺癌組織及40例正常肺組織的表達(dá)，分析其表達(dá)與臨床病理特征、復(fù)發(fā)率間的關(guān)系。采用Western blot檢測(cè)Lipocalin-2在肺鱗癌和腺癌組織的表達(dá)差異。結(jié)果Lipocalin-2、MMP-9在肺癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常肺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且Lipocalin-2表達(dá)與MMP-9呈顯著正相關(guān)(r=0.586，P<0.05)。Lipocalin-2陽(yáng)性表達(dá)率隨著腫瘤TNM臨床分期的增高及淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而增高。Lipocalin-2高表達(dá)者術(shù)后3年肺癌復(fù)發(fā)率顯著高于低表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Lipocalin-2在肺腺癌組織的表達(dá)高于鱗癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論肺癌組織Lipocalin-2的異常高表達(dá)參與了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程，可作為預(yù)后判斷的指標(biāo)。

肺腫瘤；脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2；預(yù)后

肺癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，患者預(yù)后差，致死率高。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2(Lipocalin-2)是載脂蛋白家族成員之一，其表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡、胰島素抵抗、代謝綜合征及血管病變等多個(gè)生理和病理過(guò)程有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Lipocalin-2在乳腺癌等上皮細(xì)胞腫瘤中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)[1]。本研究采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)Lipocalin-2在肺癌組織的表達(dá),旨在探討Lipocalin-2表達(dá)與基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年1月至2012年12月我院手術(shù)切除的肺癌組織標(biāo)本55例，均經(jīng)病理確診，男39例，女16例；年齡34～76歲，中位年齡53.6歲；患者術(shù)前均未接受放療、化療和內(nèi)分泌治療，臨床病理資料完整。病理類(lèi)型：鱗癌24例，腺癌18例，小細(xì)胞癌13例。TNM臨床分期參照2002年UICC制定的標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ+Ⅱ期22例，Ⅲ+Ⅳ期33例。55例肺癌患者中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例。另取40例正常肺組織作為對(duì)照。2組患者年齡、性別比、體重等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 試劑 兔抗鼠Lipocalin-2多克隆抗體、兔抗人MMP-9多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。免疫組化SP試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化：采用免疫組織化學(xué)染色SP法測(cè)定Lipocalin-2、MMP-9的表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。判定標(biāo)準(zhǔn)：Lipocalin-2、MMP-9陽(yáng)性染色的判定標(biāo)準(zhǔn)為在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中檢出黃色或棕黃色顆粒。隨機(jī)選取5個(gè)有代表性的視野(×400)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，若陽(yáng)性細(xì)胞占同類(lèi)細(xì)胞的百分比≥10%為陽(yáng)性，<10%為陰性。

1.3.2 Western blot：取凍存肺癌組織及正常肺組織石蠟標(biāo)本，Western blot 檢測(cè)Lipocalin-2蛋白表達(dá)。提取組織總蛋白，BCA法定量蛋白后進(jìn)行SDS-聚丙酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，特異性一抗4℃孵育過(guò)夜，IgG二抗孵育2 h，ECL顯色。采用UVP分析軟件對(duì)目的條帶及內(nèi)參照條帶做灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 Lipocalin-2、MMP-9蛋白在肺癌及正常肺組織的表達(dá) Lipocalin-2、MMP-9蛋白主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，呈線(xiàn)狀棕黃色顆粒。在正常肺組織Lipocalin-2僅少量表達(dá)(7.5%)，MMP-9不表達(dá)，二者在肺癌組織均高表達(dá)(分別為78.2%和81.8%)，與正常肺組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組Lipocalin-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平比較 例(%)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2 Lipocalin-2表達(dá)與MMP-9的關(guān)系 43例Lipocalin-2表達(dá)陽(yáng)性的肺癌組織中MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率為79.1%(34/43)，12例Lipocalin-2表達(dá)陰性的肺癌組織中MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率為16.7%(2/12)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.134，P<0.05)。Spearman等級(jí)相關(guān)性分析顯示，Lipocalin-2、MMP-9表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.586，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 Lipocalin-2、MMP-9在肺癌組織表達(dá)的相關(guān)性比較 例

2.3 Lipocalin-2表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系 Lipocalin-2陽(yáng)性表達(dá)率隨著腫瘤TNM臨床分期的增高及淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而增高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 Lipocalin-2在不同病理類(lèi)型肺癌組織的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，Lipocalin-2在肺腺癌組織的表達(dá)較鱗癌及正常肺組織顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而肺鱗癌組織和正常肺組織比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 Lipocalin-2在不同病理類(lèi)型肺癌組織的表達(dá)

類(lèi)別β-actinLipocalin-2Lipocalin-2/β-actin相對(duì)灰度值肺腺癌組織(n=18)68.21±2.3759.32±1.030.87±0.06*肺鱗癌組織(n=24)70.22±2.4641.56±0.770.59±0.11正常肺組織(n=40)74.25±2.7739.89±1.010.54±0.08

注：與正常肺組織比較，*P<0.05

2.5 Lipocalin-2表達(dá)與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 術(shù)后對(duì)肺癌患者跟蹤隨訪(fǎng)3年，結(jié)果顯示，55例肺癌患者3年總復(fù)發(fā)率為41.8%(23/55)，Lipocalin-2陽(yáng)性表達(dá)復(fù)發(fā)率為58.1%(25/43)，Lipocalin-2陰性表達(dá)復(fù)發(fā)率為25.0%(3/12)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

Lipocalin-2，即中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，是屬于Lipocalin超家族的一種脂肪細(xì)胞因子，其最早被Kjeldsen等[2]在中性粒細(xì)胞上清液中發(fā)現(xiàn)并分離。研究顯示，Lipocalin-2具有廣泛的生物學(xué)功能，在炎癥、代謝綜合征、糖尿病及胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化等病理過(guò)程中扮演重要角色，可作為這些疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)及預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，Lipocalin-2的異常表達(dá)參與了包括乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程[3,4]，且隨著不同的組織類(lèi)型其表達(dá)水平呈現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)。

惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟是通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)成分和基底膜突破基質(zhì)屏障，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是發(fā)揮降解作用的最重要蛋白水解酶，而MMP-9被認(rèn)為是MMPs中與Lipocalin-2功能聯(lián)系最緊密的成員，與腫瘤擴(kuò)散、侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，Lipocalin-2與MMP-9在肺癌組織均異常高表達(dá)，且二者表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.586，P<0.05)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的在乳腺癌和口腔癌中的研究結(jié)果[5,6]一致，提示Lipocalin-2作為一種轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因直接促進(jìn)了癌細(xì)胞的侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。既往研究顯示，Lipocalin-2與MMP-9之間可能存在某種調(diào)控作用，共同參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能為L(zhǎng)ipocalin-2通過(guò)促進(jìn)MMP-9活化、抑制MMP-9降解，促進(jìn)了腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程[7]。Western blot結(jié)果顯示，Lipocalin-2在肺腺癌組織的表達(dá)多于鱗癌組織，與Cho 等[8]研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了Lipocalin-2高表達(dá)與肺腺癌密切有關(guān)。本研究結(jié)果也顯示，Lipocalin-2陽(yáng)性表達(dá)率隨著肺癌臨床分期的增高和淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而增高，另外，Lipocalin-2陽(yáng)性表達(dá)率高的患者術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)率顯著高于Lipocalin-2陰性表達(dá)者，提示Lipocalin-2陽(yáng)性患者具有更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移潛能，腫瘤惡性程度更高，預(yù)后更差。

綜上所述，Lipocalin-2在肺腺癌組織過(guò)度表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤TNM臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，減低或敲除Lipocalin-2表達(dá)有可能成為肺癌生物學(xué)治療的新策略。由此可見(jiàn)，Lipocalin-2在促進(jìn)肺癌發(fā)展進(jìn)程中起非常重要的作用，其表達(dá)水平可為評(píng)價(jià)肺癌發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后提供重要參考價(jià)值，有可能成為肺癌臨床治療的新靶標(biāo)及判斷轉(zhuǎn)移和預(yù)后的重要預(yù)測(cè)因子。

1 Yang J,McNeish B,Butterfield C,et al.Lipocalin 2 is a novel regulator of angiogenesis in human breast cancer.FASEB J,2013,27:45-50.

2 Kjeldsen L,Johnsen AH,Sengelov H,et al.Isolation and primary structure of NGAL,a novel protein associated with human neutrophil gelatinase.J Biol Chem,1993,268:10425-10432.

3 Leng X,Ding T,Lin H,et al.Inhibition of lipocalin 2 impairs breast tumorigenesis and metastasis.Cancer Res,2009,69:8579-8584.

4 Tung MC,Hsieh SC,Yang SF,et al.Knockdown of lipocalin-2 suppresses the growth and invasion of prostate cancer cells.Prostate,2013,73:1281-1290.

5 Sung H,Choi JY,Lee SA,et al.The association between the preoperative serum levels of lipocalin-2 and matrix metalloproteinase-9(MMP-9) and prognosis of breast cancer.BMC Cancer,2012,12: 193.

6 Lin CW,Tseng SW,Yang SF,et al.Role of lipocalin 2 and its complex with matrix metalloproteinase-9 in oral cancer.Oral Dis,2012,18:734-740.

7 須靜，胡曉波.中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的研究進(jìn)展．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27:871-876.

8 Cho H,Kim JH.Lipocalin 2 expressions correlate siginificantly with tumor differentiation in epithelial ovarian cancer.J Histochem Cytochem,2009,57:513-521.

RelationshipbetweentheexpressionofLipocalin-2andtheprognosisofpatientswithprimarylungcancer

MAXiaogang,YANGXiaoguang,ZHAOZheng.DepartmentofThoracicSurgery,HandanCentralHospital,Hebei,Handan056001,China

ObjectiveTo investigate the expression of Lipocalin-2 and its relationship with MMP-9 as well as prognosis of patients with primary lung cancer.MethodsThe expression levels of Lipocalin-2 and MMP-9 were detected by immunohistochemistry(SP) in 55 cases of lung cancer tissues and 40 cases of normal lung tissues.The relationship between Lipocalin-2 expression and clinicopathological features of lung cancer as well as relapse rate was analyzed.Western blot was used to detect the expression of Lipocalin-2 in lung adenocarcinoma and lung squamous carcinoma.ResultsThe positive expression rates of Lipocalin-2 and MMP-9 in lung cancer tissues were significantly higher than those of normal lung tissues(P<0.05),furthermore,the expression of Lipocalin-2 was positively correlated to that of MMP-9(r=0.586,P<0.05).The positive expression rate of Lipocalin-2 was increased,with the increase of clinical stage and lymph node metastasis of lung cancer.The 3-year relapse rate after operation in patients with higher expression of Lipocalin-2 was significantly higher than that in patients with lower expression of Lipocalin-2(P<0.05).The expression levels of Lipocalin-2 in lung adenocarcinoma were significantly higher than those in lung squamous carcinoma(P<0.05).ConclusionThe overexpression of Lipocalin-2 plays an important role in the invasion and metastasis of primary lung cancer,which can be used as a index for evaluating prognosis of patients with lung cancer．

lung cancer; lipocalin-2; prognosis

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.008

056001 河北省邯鄲市中心醫(yī)院胸外科

R 734.2

A

1002-7386(2014)11-1626-03

2013-12-15)