任艷玲，劉 斌，陳艷露，李永江

(1 廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/應(yīng)用微生物研究所，廣西 南寧 530005； 2 貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550000)

東方圓盤菌及其無(wú)性型

任艷玲1,2，劉 斌1，陳艷露1，李永江1

(1 廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/應(yīng)用微生物研究所，廣西 南寧 530005； 2 貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550000)

【目的】東方圓盤菌Orbiliaorientalis及其無(wú)性型的鑒定.【方法】從枯樹枝上采集標(biāo)本；通過(guò)子囊孢子彈射法分離到其無(wú)性型.【結(jié)果和結(jié)論】該標(biāo)本被鑒定為Orbiliaorientalis；無(wú)性型被鑒定為Drechslerellacf.brochopaga；建立了有性型Orbiliaorientalis和無(wú)性型Drechslerellacf.brochopaga之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系.

東方圓盤菌有性型； 東方圓盤菌無(wú)性型； 有性型無(wú)性型對(duì)應(yīng)關(guān)系

Nannfeldt[1]1932年建立了圓盤菌科Orbiliaceae，F(xiàn)ries[2]1835年以O(shè)rbilialeucostigmaFr. 為模式種建立了圓盤菌屬OrbiliaFries.該屬的典型特征是子囊盤較小，顏色鮮亮，蠟質(zhì)，半透明.劉斌等[3]2007年報(bào)道CABI數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄了該屬247個(gè)名稱，但其中僅有50個(gè)左右是圓盤菌屬成員，2001年Kirk等[4]主編的《Dictionary of the Fungi》僅承認(rèn)34個(gè)種，目前報(bào)道的來(lái)自中國(guó)的圓盤菌有32個(gè)種[3,5-16].該菌存在有性型和無(wú)性型，這給真菌分類帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)，因此，找到有性型和無(wú)性型的對(duì)應(yīng)關(guān)系顯得尤為重要，本研究于2012年8月對(duì)廣西武鳴縣大明山地區(qū)進(jìn)行了調(diào)查和研究，發(fā)現(xiàn)了東方圓盤菌Orbiliaorientalis(Raitv.) Baral，并通過(guò)分離得到其對(duì)應(yīng)的無(wú)性型.

1 材料與方法

1.1 材料

2012年8月3日于廣西壯族自治區(qū)武鳴縣大明山采集到東方圓盤菌Orbiliaorientalis(Raitv.) Baral，該標(biāo)本保存于廣西大學(xué)應(yīng)用微生物研究所標(biāo)本室.照相及觀察所用顯微鏡：尼康ECLIPSE 80i顯微鏡、尼康SZ-ST解剖鏡、尼康Digital·Slight DS-LI顯微攝影系統(tǒng).

1.2 形態(tài)學(xué)觀察及無(wú)性型的獲得

通過(guò)對(duì)標(biāo)本的宏觀觀察和切片，記錄其形態(tài)特征并拍照.無(wú)性型的獲得是采用子囊孢子彈射法，即用無(wú)菌的、直徑為5 mm 的打孔器在20 g·L-1水瓊脂平板中央打孔，將該瓊脂塊取出并貼于培養(yǎng)皿蓋內(nèi)，挑取1個(gè)子囊盤置于瓊脂塊表面，蓋上培養(yǎng)皿后正置于桌上，讓子囊孢子向下彈射到培養(yǎng)基上.培養(yǎng)皿蓋每隔 2 h旋轉(zhuǎn)1次，并在培養(yǎng)皿底部標(biāo)記彈射的位置，彈射完畢后可獲得不同的孢子印，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，子囊孢子萌發(fā)后轉(zhuǎn)接分離獲得純培養(yǎng).

1.3 總DNA提取及系統(tǒng)樹的構(gòu)建

對(duì)該菌無(wú)性型進(jìn)行純培養(yǎng)，參照Doyle等[17]的方法.引物為ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;LR5：5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′.PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer (含Mg2+) 5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 4 μL，1.0 μmol·L-1引物ITS1 2 μL，1.0 μmol·L-1引物L(fēng)R5 2 μL，5 U·μL-1Taq聚合酶0.5 μL，模板DNA 1.5 μL，最后加雙蒸水至50 μL.PCR反應(yīng)條件為94 ℃，5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min.將所得序列測(cè)序后與GenBank上的相關(guān)序列用Clustal X軟件[18]進(jìn)行對(duì)比，并用MEGA 3.0[19]中的Neighbor-Joining法構(gòu)建該序列的系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 東方圓盤菌的形態(tài)學(xué)觀察

子囊盤(圖1A)表生于空中懸掛的枯樹枝，無(wú)柄，蠟質(zhì)，半透明，盤中央緊貼基部，光滑，平整，新鮮時(shí)半透明，淺黃色，干后橙黃色，具有平滑的邊緣，盤直徑為0.3～1.1 mm；外囊盤被由近球形或者球形細(xì)胞組成，直徑為3.4～6.6 μm，細(xì)胞壁薄或者輕微加厚，邊緣細(xì)胞加長(zhǎng)；子囊(圖1C、1D、1F)為圓柱形至棍棒形，長(zhǎng)度為29.8～36.2 μm，寬度為3.2～4.4 μm，頂部鈍圓形或者平截形，基部逐漸變細(xì)，有時(shí)呈L形，具有8個(gè)子囊孢子；子囊孢子(圖1E)透明，無(wú)隔，長(zhǎng)橢圓形至短柱形，兩端鈍圓，長(zhǎng)度為3.1～4.3 μm，寬度為1.2～1.5 μm，在子囊內(nèi)不重疊并且單排排列，一端具有一個(gè)折光性很強(qiáng)的球形孢子體，孢子體直徑為0.8～1.1 μm，充滿整個(gè)子囊孢子的頂端；側(cè)絲(圖1B)無(wú)色，透明，無(wú)分隔，頂端膨大成球形或輕微膨大，球形直徑為2.1～2.8 μm.

2.2 東方圓盤菌無(wú)性型

東方圓盤菌在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)8 d，如圖2所示，菌落直徑為42 mm，邊緣生長(zhǎng)整齊且均勻；菌絲無(wú)色透明，有分隔和分枝，寬度為2.1～3.1 μm；分生孢子梗直立，長(zhǎng)度為80～220 μm，基部寬2.1～2.8 μm，頂端常具有短的小分枝，一般為2～5個(gè)，分枝寬度為1.6～1.9 μm，長(zhǎng)度為2.8～4.5 μm，在每個(gè)小分枝頂端著生1個(gè)分生孢子；分生孢子形狀為圓柱形至棍棒形，有的稍微彎曲，頂端半圓形，基部平截形，長(zhǎng)度為14.3～20.9 μm，寬度為4.5～6.2 μm，1～3個(gè)分隔，以2個(gè)分隔為主.

A: 新鮮子囊盤；B：側(cè)絲；C: 子囊和側(cè)絲；D: 子囊； E: 子囊孢子；F: 子囊和側(cè)絲. A：標(biāo)尺=2 mm； B～F：標(biāo)尺=10 μm.

圖1 東方圓盤菌有性型形態(tài)特征

Fig.1 The morphological characteristics ofOrbiliaorientalisteleomorph

A～D：分生孢子梗和分生孢子；E：分生孢子；F：收縮環(huán). A～F：標(biāo)尺=15 μm.

圖2 東方圓盤菌無(wú)性型形態(tài)特征

Fig.2 The morphological characteristics ofDrechslerellacf.brochopagaanamorph

2.3 分子系統(tǒng)學(xué)分析

對(duì)所測(cè)Drechslerellacf.brochopaga序列和從GenBank下載的Drechslerellabrochopag(Drechsler) M. Scholler、Drechslerelladactyloides(Drechsler) M. Scholler、DactylellaatractoidesDrechsler、Dactylellacylindrospora(R.C. Cooke) A. Rubner、OrbiliaquerciBin Liu, Xing Z. Liu & W.Y. Zhuang、Orbiliaauricolor(A. Bloxam) Sacc.、ArthrobotryssuperbaCorda、ArthrobotryscladodesDrechsler、OrbiliafimicolaJeng & J.C. Krug、Orbilialuteorubella(Nyl.) P. Karst序列用Clustal X軟件進(jìn)行對(duì)比，以HyalorbiliabrevisipitisBin Liu, Xing Z. Liu & W.Y. Zhuang為外群，基于ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)用MEGA 3.0中的Neighbor-Joining法構(gòu)建.

Drechslerellacf.brochopaga及其相關(guān)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹明顯形成4個(gè)聚集區(qū)，Drechslerellacf.brochopaga、Drechslerellabrochopag、Drechslerelladactyloides聚集在一起，均以收縮環(huán)來(lái)捕食線蟲；Dactylellaatractoides和Dactylellacylindrospora聚集在一起，不能誘導(dǎo)出捕食線蟲的捕食器官；Dactylellinahaptospora和Orbiliaquerci聚集在一起，Dactylellinahaptospora和Orbiliaquerci的無(wú)性型以粘球來(lái)捕食線蟲；Orbiliaauricolor、Arthrobotryssuperba、Arthrobotryscladodes和Orbiliafimicola聚集在一起，Orbiliaauricolor的無(wú)性型、Arthrobotryssuperba、Arthrobotryscladodes和Orbiliafimicola的無(wú)性型以菌網(wǎng)來(lái)捕食線蟲.

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的Drechslerella cf. brochopaga及其相關(guān)種的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.3 Phylogenetic tree ofDrechslerellacf.brochopagaand related species using the neighbor joining method based on ITS sequence data

3 討論與結(jié)論

1991年Raitviir最早報(bào)道了Orbiliaorientalis，根據(jù)子囊盤邊緣具有透明絲狀物而將它歸在HyaliniaBoud.中[20]；1994年Baral[21]認(rèn)為子囊盤邊緣具有透明絲狀物在屬的分類上意義不是太大，所以將Hyalinia處理為Orbilia的異名.本試驗(yàn)采集的材料中，子囊盤邊緣沒有觀察到毛，這可能是種內(nèi)差異造成的；Orbiliaorientalis與OrbiliaepiporaKarst子囊孢子相似，但前者的孢子一端明顯有1個(gè)折光性很強(qiáng)的孢子體，后者沒有.

有性型與無(wú)性型的對(duì)應(yīng)關(guān)系是真菌研究熱點(diǎn)之一，圓盤菌屬產(chǎn)生的無(wú)性型種類比較多，1997年P(guān)fister[22]對(duì)圓盤菌屬7個(gè)種產(chǎn)生的13個(gè)無(wú)性型菌株及7個(gè)來(lái)源于分生孢子的菌株進(jìn)行rDNA 18S和ITS區(qū)間的序列分析，建立了系統(tǒng)發(fā)育樹，所有供試的菌株均能很好地聚于圓盤菌科內(nèi).1997年Liou 等[23]也對(duì)來(lái)自于29種捕食線蟲絲孢菌和5種非捕食的種類進(jìn)行ITS及5.8S片段的序列分析，結(jié)果表明28種捕食線蟲絲孢菌可根據(jù)捕食器官聚類為4個(gè)類群，即黏網(wǎng)、收縮環(huán)、有柄黏球和非收縮環(huán)、黏性柱和無(wú)柄黏球.本研究用東方圓盤菌的無(wú)性型菌株序列和GenBank下載的其他圓盤菌序列或者相關(guān)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，該結(jié)果和Liou等[23]1997年得出的結(jié)果相似，這些序列明顯形成4個(gè)聚集區(qū)，即以收縮環(huán)來(lái)捕食線蟲的聚集區(qū)、以粘球來(lái)捕食線蟲的聚集區(qū)、以菌網(wǎng)來(lái)捕食線蟲的聚集區(qū)和不能捕食線蟲的聚集區(qū).東方圓盤菌的無(wú)性型在系統(tǒng)發(fā)育樹中位于以收縮環(huán)來(lái)捕食線蟲的聚集區(qū)，這和形態(tài)學(xué)觀察到的結(jié)果是一致的.另外，此無(wú)性型和Drechslerellabrochopaga聚集在一起，形態(tài)上兩者也比較相似，應(yīng)該是同一個(gè)種，但兩者之間也有一些不同，如前者分生孢子梗頂部為短分枝，后者分生孢子梗頂部為不明顯的瘤突，并且前者產(chǎn)生的分生孢子也比后者小，兩者的ITS序列也存在有差異，在此鑒定為Drechslerellacf.brochopaga.

東方圓盤菌的無(wú)性型可以產(chǎn)生捕食線蟲的收縮環(huán)，而捕食線蟲真菌是線蟲病害的一個(gè)重要的生防因子，該菌經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究可以開發(fā)成生防制劑，用于農(nóng)業(yè)線蟲病害的防治，從而避免使用化學(xué)農(nóng)藥防治線蟲病害帶來(lái)的化學(xué)殘留和環(huán)境污染，在經(jīng)濟(jì)和生態(tài)學(xué)上具有重要的價(jià)值.

[1] NANNFELDT J A. Studien uber die morphohogie und systematik der nicht-lichenisierten inoperculaten discomyceten:Series 8[M].Uppsala:A.B.L.Norblands Bokhandel, 1932: 5-337.

[2] FRIES E M. Corpus florarum provincialium sueciae, I. floram scanicam[M]. Montana:Nabu Press, 1983:394.

[3] 劉斌，劉杏忠，莊文穎，等．圓盤菌屬中國(guó)新記錄種[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2007，26(4): 575-581.

[4] KIRK P M, CANNON P F, DAVID J C, et al. Ainsworth & aisby’s dictionary of the fungi[M]. 9thEd. Oxon: CABI Europe-UK, 2001.

[5] YU Zefen, QIAO Min, ZHANG Ying, et al.Pseudotripoconidium, a new anamorph genus connected toOrbilia[J]. Mycologia, 2011, 103(1): 164-173.

[6] ZHANG Y, YU Z F, BARAL H O, et al. New species and records ofOrbilia(Orbiliaceae, Ascomycota) from China[J]. Fungal Divers, 2009, 36: 141-153.

[7] LIU Bin, LIU Xingzhong, ZHUANG Wenying, et al. Orbiliaceous fungi from Tibet, China[J]. Fungal Divers, 2006, 22: 107-120.

[8] SU H Y, ZHANG Y, BARAL H O, et al. Four new species ofOrbiliaceaefrom Yunnan, China[J]. Mycol Prog, 2011, 10(3):373-381.

[9] QIAO Min, ZHANG Ying, LI Shifu, et al.Orbiliablumenaviensisand itsArthrobotrysanamorph[J]. Mycol Prog, 2012, 11(1): 255- 262.

[10]LIU Bin, LIU Xingzhong, ZHUANG Wenying.Orbiliaquercisp. nov. and its knob-forming nematophagous anamorph[J]. FEMS Microbiol Lett, 2005, 245(1): 99-105.

[11]YU Zefen, KONG Yanjie, ZHANG Ying, et al. A newdactylellaspecies fromOrbiliaalba[J]. J Microbiol, 2009,47(3): 265- 269.

[12]YU Zefen, QIN Li, ZHANG Ying, et al. A newDrechslerellaspecies isolated fromOrbiliacf.orientalis[J]. Mycotaxon, 2009, 110: 253- 259.

[13]ZHANG Ying, YU Zefen, QIAO Min, et al. A new species ofOrbiliafrom China[J]. Cryptogamie Mycol, 2006, 27 (4): 289- 294.

[14]YU Z F, ZHANG Y, ZHANG K Q.Orbiliadorsaliasp.nov., the teleomorph ofDactylelladorsaliasp.nov.[J].Cryptogamie Mycol, 2007, 28 (1): 55- 63.

[15]YU Zefen, QIAO Min, ZHANG Ying, et al.Orbiliavermiformissp. nov. and its anamorph[J]. Mycotaxon, 2007, 99: 271- 278.

[16]LI S F, YU Z F, ZHANG Y, et al.Arthrobotrysnonseptata, a new anamorph from anOrbiliaspecies[J]. Mycotaxon, 2009, 109: 247- 254.

[17]DOYLE J J, DOYLE J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J]. Phytochem Bull, 1987, 19: 11-15.

[18]THOMPSON J D, GIBSON T J, PLEWNIAK F, et al. The CLUSTAL-X windows interface: Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Res, 1997, 25(24): 4876- 4882.

[19]KUMAR S, TAMURA K, NEI M. MEGA3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment[J]. Brief Bioinform, 2004, 5(2): 150-163.

[20]劉斌.中國(guó)圓盤菌科分類及分子系統(tǒng)學(xué)研究[D].北京：中國(guó)科學(xué)院研究生院，2006.

[21]BARAL H O. Comments on “outline of the ascomycetes-1993”[J]. Syst Ascomycetum, 1994: 113-128.

[22]PFISTER D H. Castor, pollux and the life histories of fungi[J]. Mycologia, 1997, 89(1): 1- 23.

[23]LIOU G Y, TZEAN S S. Phylogeny of the genusArthrobotrysand allied nematode-trapping fungi based on rDNA sequences[J]. Mycologia, 1997, 89(6): 876- 884.

【責(zé)任編輯霍 歡】

Orbiliaorientalisanditsanamorph

REN Yanling1,2, LIU Bin1, CHEN Yanlu1, LI Yongjiang1

(1 Agricultural College，Guangxi University/Institute of Applied Microbiology, Nanning 530005, China; 2 Guizhou Light Industrial Vocational College, Guiyang 550000, China)

【Objective】To identify theOrbiliaorientaliscollected from dead branches. 【Method】Its anamorph was isolated from the ascospores ofOrbiliaorientalis. 【Result and conclusion】The anamorph was identified asDrechslerellacf.brochopaga.The connection between anamorphOrbiliaorientalisand teleomorphDrechslerellacf.brochopagawas established.

Orbiliaorientalis;Drechslerellacf.brochopaga; teleomorph-anamorph connection

2013- 04- 09優(yōu)先出版時(shí)間2014- 01- 03

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20140103.0829.017.html

任艷玲(1980—)，女，博士研究生，E-mail：43182481@qq.com；通信作者：劉 斌(1966—)，男，教授，博士，E-mail: liubin@gxu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(30860006)

任艷玲，劉 斌，陳艷露，等.東方圓盤菌Orbiliaorientalis及其無(wú)性型[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014,35(2):57- 60.

Q939.5

A

1001- 411X(2014)02- 0057- 04