石俊松，田存鋒，許繼國，張秀娟，李 莉，張守全

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642）

虎屬于哺乳綱、食肉目、貓科、豹屬、虎種，一般虎被分為8個亞種，現(xiàn)僅存5個亞種.在這僅存的5個亞種中，華南虎 Panthera tigris amoyensis、東北虎P.tigris altaica和孟加拉虎P.tigris tigris也瀕臨滅絕，尤其是華南虎.為了成功地保護(hù)物種，除了要保護(hù)其棲息地和最大限度地增加種群數(shù)量外，還必須保護(hù)其遺傳多樣性.遺傳多樣性貧乏的物種，在環(huán)境中將十分脆弱，因而其進(jìn)化前景暗淡［1］.

為了制定有效的繁殖對策，以最大限度地保存圈養(yǎng)虎群體的遺傳多樣性，必須首先弄清起源群體的遺傳結(jié)構(gòu)，這是任一圈養(yǎng)動物繁殖中迫切需要解決的問題.由于虎類是一個比較年輕的類群，亞種間基因進(jìn)化較保守，單一基因的信息量尚不足以解決該類群的系統(tǒng)發(fā)育問題，增加新的DNA序列的研究是解決問題的關(guān)鍵之一.同時，采用多基因序列數(shù)據(jù)也是由基因樹到物種樹的必然要求.近年來，人們開始注意線粒體DNA(mtDNA)在系統(tǒng)進(jìn)化研究中的作用，同時人們已經(jīng)把它們用于貓科動物的系統(tǒng)進(jìn)化研究［2-3］.哺乳動物的線粒體DNA是雙鏈環(huán)狀DNA，能夠獨立復(fù)制，不與組蛋白結(jié)合，另外，線粒體DNA所具有的線粒體基因組復(fù)制與表達(dá)所需的多種酶則由核基因編碼，因此，線粒體是一個半自主性細(xì)胞器［4］.White等［5］研究發(fā)現(xiàn)線粒體 DNA 沒有內(nèi)含子，缺乏有效的基因修復(fù)系統(tǒng)，極易發(fā)生突變，與核DNA相比，mtDNA具有母系遺傳、拷貝數(shù)多、突變率高和極少發(fā)生重組等特性，是研究分子生態(tài)學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化和群體遺傳學(xué)的一個關(guān)鍵工具;其中mtDNA高突變率和極少發(fā)生重組的特性，使得較短時間內(nèi)積累的變異可以連續(xù)而忠實地遺傳下去，通過分析這些變異的分布范圍與頻率等信息，從而可以更好地研究種群關(guān)系及系統(tǒng)進(jìn)化.

鄭濤［6］利用中國產(chǎn)13種貓科動物的12SrRNA基因(約371 bp)和Cytb部分序列(約355 bp)進(jìn)行了分析，其構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示了云豹、豹、雪豹和虎具有較近的親緣關(guān)系，支持將它們同歸于豹屬的觀點.Luo等［3］對134份虎樣本的4 kb mtDNA序列進(jìn)行了分析，提出現(xiàn)存的虎有6個亞種:東北虎、北印支虎、華南虎、馬來虎、蘇門答臘虎和孟加拉虎.張文平等［7］利用線粒體DNA的D-loop區(qū)及ND5部分序列構(gòu)建了東北虎、孟加拉虎和華南虎的系統(tǒng)進(jìn)化樹.韋鹍［8］利用mtDNA的ND5基因研究了華南虎的遺傳多樣性.本文主要利用mtDNA COⅠ基因、COⅢ基因和ND4基因部分序列來構(gòu)建東北虎、孟加拉虎和華南虎的系統(tǒng)進(jìn)化樹，探討3種虎的進(jìn)化關(guān)系，也為虎的物種樹的建立提供一些依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料來源和mtDNA提取

本試驗采集了廣西熊虎山莊東北虎和孟加拉虎的血液樣品，每種取3～4個個體，其中東北虎個體編號為Pta01、Pta02、Pta03和Pta04，孟加拉虎編號為Ptt01、Ptt02、Ptt03和Ptt04.將虎麻醉后從尾部靜脈采全血10 mL，按 V(血液)∶V(ACD 抗凝劑)=6∶1的比例混勻抗凝，于－80℃條件保存?zhèn)溆?華南虎肌肉組織樣來自廣州動物園自然死亡的1頭華南虎，編號為Pts01.

線粒體DNA的提取結(jié)合了DNA總基因組和質(zhì)粒DNA的提取方法，并對常規(guī)酚－氯仿抽提法改進(jìn).所得的mtDNA溶于TE緩沖液中，－20℃條件保存?zhèn)溆?

1.2 PCR 擴增

根據(jù)從NCBI GenBank上搜索得到的家貓Felis catus(NC_001700)、獵豹 Acinonyx jubatus(NC_005212，)、云豹 Neofelis nebulosa(NC_008450) 的mtDNA全序列，利用DNAssist 1.0比對，選取序列的保守區(qū)，利用Primer permier 5.0軟件設(shè)計引物，并由Oligo檢驗，最后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.COⅠ引物序列為:F-GCTCGAACCTCTGTCTTTAG，R-CCAAAACCGGGTAGGATTAA;COⅢ引物序列為:F-GCCTATGTTTTTACCCTGCT，R-CTACGTCTACGAAGTGTCAA;ND4引物序列為:F-GGCAATCAAACAGAGCG，R-GGAAGTTAGTCCGTGGG.

PCR擴增條件:25 μL反應(yīng)體系含50 ng基因組模板，1 × PCR 緩沖液，8 μmol/L 引物，200 μmol/L dNTP，1.5 mmol/L Mg2+，1 U Taq DNA 聚合酶.94 ℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，35個循環(huán);72℃延伸50 s，72℃后延伸5 min，4℃條件下保存產(chǎn)物.

1.3 產(chǎn)物的回收和測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后，由DNA膠回收試劑盒(上海生工)回收純化，并與 pMD18-T載體(TaKaRa公司)連接，然后轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)藍(lán)白篩選，送陽性克隆的菌液到上海英駿生物科技有限公司測序.

1.4 序列分析及構(gòu)建進(jìn)化樹

所有測得的序列比對(Sequence alignment)使用DNAStar軟件包的 EditSeq、SeqMan、Megalign 等軟件進(jìn)行編輯，并進(jìn)行人工校對，以確保序列的準(zhǔn)確性.然后用DNAssit分析各物種間各個序列間的差異，單倍型多樣度.用DNAStar等計算序列的堿基組成及序列間的轉(zhuǎn)換/顛換值、遺傳距離，并計算序列的堿基組成百分率等.

選擇家貓、獵豹及云豹的mtDNA作為外群，利用Mega 4.0采用鄰接法(Neighbour-joining，NJ)重建華南虎、東北虎、孟加拉虎的進(jìn)化關(guān)系樹，系統(tǒng)樹中節(jié)點的自助置信水平(Bootstrap confidence level，BCL)應(yīng)用自引導(dǎo)估計，共1000次循環(huán).

2 結(jié)果

2.1 華南虎、孟加拉虎和東北虎的mtDNA序列

通過測序，共得到25個序列，其中COⅠ基因8個個體(東北虎3個、孟加拉虎4個、華南虎1個)各755 bp(NCBI GenBank登錄號:FJ422123，F(xiàn)J422145，F(xiàn)J455122，F(xiàn)J455124，F(xiàn)J455125，F(xiàn)J461529 ～461531);COⅢ基因8個個體(東北虎4個、孟加拉虎4個)各742 bp，華南虎1個個體737 bp(NCBI GenBank登錄號:FJ461532 ～461534，F(xiàn)J465508 ～465511，F(xiàn)J469625);ND4基因8個個體(東北虎3個、孟加拉虎4個、華南虎1個)各561 bp(NCBI GenBank登錄號:FJ608583～608585，F(xiàn)J694968 ～694972).

2.2 序列差異及分析

2.2.1 COⅠ基因 通過DNAssist軟件對這些序列的優(yōu)化及比對，發(fā)現(xiàn)3只東北虎中出現(xiàn)3種線粒體COⅠ單倍型，共有2個變異位點;4只孟加拉虎出現(xiàn)2種線粒體COⅠ單倍型，只有1個變異位點.

由序列比對可知，8個個體的序列共檢測到多態(tài)位點13個，占分析位點總數(shù)(750 bp)的1.73%，2核苷酸間的變異位點13個，無3核苷酸間的變異位點.因此，3個虎亞種的mtDNA COⅠ基因序列變異主要有轉(zhuǎn)換和顛換2種類型，無轉(zhuǎn)換與顛換共存的現(xiàn)象.東北虎、孟加拉虎、華南虎和云豹的序列兩兩堿基替換情況和遺傳距離列于表1.

表1 東北虎、孟加拉虎、華南虎和云豹的COⅠ序列間的轉(zhuǎn)換/顛換(上三角)和遺傳距離(下三角)Tab.1 Numbers of transition/transversion(upper-right matrix)and genetic distances(Kimura 2-parameter model，lowerleft matrix)for COⅠsequences of Siberian tiger，Bengal tiger，South China tiger and clouded leopard

從表1中可以看出:虎亞種間的Kimura 2-parameter遺傳距離范圍為0.0013～0.0148，變異程度較大，亞種之間距離最小的為東北虎和孟加拉虎，最大的為東北虎同華南虎;東北虎個體之間的遺傳距離和孟加拉虎個體之間遺傳距離均小于亞種之間的遺傳距離.云豹和虎亞種之間的距離范圍是0.1492～0.1615，其中和華南虎最小，和東北虎最大.

2.2.2 COⅢ基因 對4個東北虎個體、1個華南虎個體和4個孟加拉虎個體的mtDNA進(jìn)行了克隆測序，得到了這9個個體各737 bp的序列.通過DNAssist軟件對這些序列的優(yōu)化及比對，發(fā)現(xiàn)4只東北虎中只有1種線粒體COⅢ基因單倍型，4只孟加拉虎也只有1種線粒體COⅢ基因單倍型.可見在虎中線粒體COⅢ基因個體差異極小.

由序列比對可知，9個個體的序列共檢測到多態(tài)位點4個，約占分析位點總數(shù)(737 bp)的0.54%，2核苷酸間的變異位點4個，無3核苷酸間的變異位點.因此，3個虎亞種的mtDNA COⅢ基因序列變異主要有轉(zhuǎn)換和顛換2種類型，無插入/缺失和轉(zhuǎn)換與顛換共存的現(xiàn)象.東北虎、孟加拉虎、華南虎和云豹的序列兩兩堿基替換情況和遺傳距離列于表2.

從表2中可以看出:虎亞種間的Kimura 2-parameter遺傳距離范圍為0.0000～0.0055，變異程度較大，遺傳距離最大為東北虎和華南虎，而東北虎和孟加拉虎、華南虎和孟加拉虎之間的遺傳距離是一樣的(D=0.0027).東北虎個體之間、孟加拉虎個體之間遺傳距離均為0.云豹和虎亞種之間的遺傳距離范圍是0.1181～0.1249，變異程度較小，其中和華南虎遺傳距離最小，和東北虎遺傳距離最大.

表2 東北虎、孟加拉虎、華南虎和云豹的COⅢ序列間的轉(zhuǎn)換/顛換(上三角)和遺傳距離(下三角)Tab.2 Numbers of transition/transversion(upper-right matrix)and genetic distances(Kimura 2-parameter model，lowerleft matrix)for COⅢsequences of Siberian tiger，Bengal tiger，South China tiger and clouded leopard

2.2.3 ND4基因 對3個東北虎個體、1個華南虎個體和4個孟加拉虎個體的mtDNA進(jìn)行了克隆測序，得到了這8個個體各561 bp的序列.通過DNAssist軟件對這些序列的優(yōu)化及比對，發(fā)現(xiàn)3只東北虎只有1種線粒體ND4單倍型;4只孟加拉虎有2種線粒體ND4單倍型，總共有1個變異位點.

由序列比對可知，8個個體的序列共檢測到多態(tài)位點3個，約占分析位點總數(shù)(561 bp)的0.53%，2核苷酸間的變異位點3個，無3核苷酸間的變異位點.因此，3個虎亞種的mtDNA ND4區(qū)序列變異主要有轉(zhuǎn)換和顛換2種類型，無缺失/插入、轉(zhuǎn)換與顛換共存的現(xiàn)象.東北虎、孟加拉虎、華南虎和云豹的序列兩兩堿基替換情況和遺傳距離列于表3.

表3 東北虎、孟加拉虎、華南虎和云豹的ND4序列間的轉(zhuǎn)換/顛換(上三角)和遺傳距離(下三角)Tab.3 Numbers of transition/transversion(upper-right matrix)and genetic distances(Kimura 2-parameter model，lowerleft matrix)for ND4 sequences of Siberian tiger，Bengal tiger，South China tiger and clouded leopard

從表3可看出:虎亞種間的Kimura 2-parameter遺傳距離范圍為0.0000～0.0054，變異程度較小;華南虎和孟加拉虎2個個體的遺傳距離最大，和其他個體的遺傳距離一樣;而東北虎個體之間的遺傳距離為0.云豹和虎亞種之間的遺傳距離范圍是0.1442～0.1466，變異程度較小，其中和孟加拉虎2個個體最大，和其他個體的遺傳距離一樣.

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用Mega 4.0軟件，基于Kimura兩參數(shù)距離采用鄰接法(NJ法)來構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以云豹作為外群比較，同時引進(jìn)家貓和獵豹的同區(qū)域序列作對照.從圖1～3中可以看出該拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分為3個支系，東北虎同孟加拉虎聚在一起，自助置信水平為99%;然后再與華南虎的支系聚合.

圖1 基于COⅠ基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Neighbour-joining phylogenetic trees with the Kimura-2 parameter model based on the COⅠgene

圖2 基于COⅢ基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Neighbour-joining phylogenetic trees with the Kimura-2 parameter model based on the COⅢgene

圖3 基于ND4基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Neighbour-joining phylogenetic trees with the Kimura-2 parameter model based on the ND4 gene

3 討論

3.1 3個基因的保守性及在進(jìn)化關(guān)系中的應(yīng)用

在基因序列方面，3個基因序列呈現(xiàn)較多的一致性.3個基因序列都富含A、T，而G的含量都是最少的.張方等［9］認(rèn)為脊椎動物線粒體基因組遺傳密碼的使用存在偏倚性，密碼子的第3位堿基為A和C的比例明顯高于G和T，其中A的比例最高，G最低.

從種內(nèi)的單倍體個數(shù)來看，3個基因單倍體個數(shù)都較少，呈現(xiàn)保守性，且種間多態(tài)性位點也較少，在位點的突變中也全部是轉(zhuǎn)換和顛換，而且以轉(zhuǎn)換為主，多為無義突變.衡量一個群體mtDNA的遺傳多樣性的指標(biāo)有2個:單倍型多樣度和核苷酸多樣度.這2個指標(biāo)的值越大，群體的多樣性程度越高，遺傳多樣性越豐富，反之群體的多樣性程度越低，遺傳多樣性越貧乏.因此一方面說明這3個基因比較保守，另一方面也說明3種虎的遺傳多樣性較低.

從遺傳距離上看，不論個體還是亞種間，3個基因呈現(xiàn)的遺傳距離均較低，亞種間最高的為COⅠ基因，其最高遺傳距離才為 0.0148.Nei［10］認(rèn)為地理種群之間的遺傳距離在0.00～0.05，亞種間的遺傳距離約為0.05或更大.然而有許多例外，在有些情況下，亞種間的遺傳距離可能與地理種群間的遺傳距離一樣小.由于亞種分類可能受到人為因素的影響，在分類學(xué)實踐中亞種形態(tài)分化的標(biāo)準(zhǔn)以約75%的個體呈現(xiàn)不同為界限;另一方面，形態(tài)學(xué)變化和分子歧異之間既存在相關(guān)性，又存在獨立性［11］，在分子水平研究亞種的親緣關(guān)系時，得到的遺傳距離可能會大于或小于 Nei［10］估算的亞種間的遺傳距離.例如，Ball等［12］對紅翅黑鸝 Agelaius phoeniceus的研究和Carr等［13］對維基尼亞鹿 Odocoileus virginianus的研究都表明種群間mtDNA差異程度較小，最大的分別為 0.008 和 0.016.Ashley 等［14］對黑犀牛 Diceros bicormis 2亞種的研究也證實了這一點，2亞種之間的遺傳距離僅為0.0029.吳平等［15］利用 RFLP和PCR-RFLP技術(shù)研究東北虎和華南虎線粒體DNA多態(tài)性，結(jié)果顯示東北虎和華南虎的遺傳距離只有0.00135.

3.2 從3個基因的序列片段構(gòu)建的進(jìn)化樹看虎的進(jìn)化關(guān)系

本研究結(jié)果可以看出華南虎和東北虎、孟加拉虎的遺傳距離要大于東北虎和孟加拉虎之間的遺傳距離，而以云豹為外群構(gòu)建的進(jìn)化樹中也可以看出，3個基因序列片段構(gòu)建的進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相近，均是東北虎和孟加拉虎先合為一枝，然后與華南虎匯合;且相同的亞種都聚在各自的樹枝上，個體間的遺傳差異較小，內(nèi)群的平均遺傳距離均小于外群的遺傳距離，所以能夠很好地區(qū)分和3個亞種間的關(guān)系.Kimball等［16］研究表明，置信度大于70%的進(jìn)化枝是比較可信的，而本文構(gòu)建的基因樹除基于COⅢ基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹有1支為64%外，其余均大于70%，因此構(gòu)建的基因樹是可信的.從COⅠ、COⅢ和ND4基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹我們可以得出東北虎和孟加拉虎均是由華南虎進(jìn)化而來的結(jié)論.而譚邦杰［17］從地理位置上、張文平［1］從線粒體 DNA D-loop區(qū)和ND5基因構(gòu)建的進(jìn)化樹也均說明了3種虎的進(jìn)化由來，鑒于現(xiàn)存華南虎的數(shù)量及華南虎在虎進(jìn)化史上的地位，需要我們在華南虎的保護(hù)上作出更多的努力.

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