束建花，郭紅艷，王立琦，高 艷，曾振靈

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

呋喃它酮代謝物人工抗原的合成及抗體的制備

束建花，郭紅艷，王立琦，高 艷，曾振靈

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

呋喃它酮代謝物； 半抗原； 多克隆抗體； 酶聯(lián)免疫測定法

目前用于呋喃它酮殘留的儀器檢測方法主要有LC-MS[5]、LC-MS/MS[6].盡管該類檢測方法有很高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但所需儀器昂貴、操作復(fù)雜、耗時久，難以應(yīng)用于大規(guī)模的篩選檢測.相對來說，免疫檢測法具有簡便、快速、高靈敏和高特異性等優(yōu)點，在國內(nèi)外獸藥、農(nóng)藥殘留檢測中得以廣泛應(yīng)用，尤其是ELISA法.Pimpitak等[7]利用制備的AMOZ單克隆抗體建立了檢測蝦中AMOZ殘留的ic-ELISA方法，以CPAMOZ為競爭物，IC50值為(1.19±0.03) ng·mL-1.Diblikova等[8]以直鏈作間隔臂合成了新型半抗原，制備的抗體對AMOZ并無抑制率，經(jīng)分析半抗原分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、空間構(gòu)象過于簡單及間隔臂封閉作用都可能是導(dǎo)致抗體無特異性的因素.本研究旨在以CPAMOZ-BSA和AMOZ-BSA為免疫原對Babl/c小鼠進行免疫，通過ic-ELISA方法測定鼠血清多抗克隆特性，對結(jié)果進行比較分析，篩選出最佳的免疫原和包被原組合，為進一步制備單克隆抗體和提高動物性食品中AMOZ殘留檢測的ic-ELISA方法的靈敏度奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗動物

健康雌性SPF級Balb/c小鼠，4～6周齡，購自廣東省實驗動物中心，飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家獸藥殘留基準(zhǔn)實驗室動物觀察室.

1.2 試劑與藥品

AMOZ由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院藥理實驗室合成；戊二醛為上海凌峰化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)為上海金穗生物科技有限公司產(chǎn)品；對醛基苯甲酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)、N-羥基琥珀酸亞胺(NHS)均為阿拉丁試劑公司產(chǎn)品；AMOZ標(biāo)準(zhǔn)品、FTD標(biāo)準(zhǔn)品、NPAMOZ標(biāo)準(zhǔn)品、羊抗鼠IgG-HRP、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑為美國Sigma公司產(chǎn)品.

1.3 主要儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器)，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(安捷倫6430)，紫外/可見分光光度計(島津公司)，酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo scientific公司)，離心機(Thermo scientific公司)，磁力攪拌器(鞏義市予華儀器廠).

1.4 免疫原AMOZ-BSA、包被原AMOZ-OVA的制備

在安裝有磁力攪拌器裝置的燒杯中加入16.8 mg BSA 和1 mL PBS(0.05 mol·L-1，pH=7.4)，稱取5.3 mg AMOZ溶于0.4 mL PBS(0.05 mol·L-1，pH=7.4)，待BSA完全溶解后加入已溶解完全的AMOZ溶液，攪拌過程中將30 μL戊二醛溶液逐滴加入，反應(yīng)過程中可見反應(yīng)液顏色逐漸變深至青黃色，室溫反應(yīng)2 h后置于冰水浴中.稱取25 mg NaBH4分批加入上述反應(yīng)液，約20 min后反應(yīng)液顏色逐漸褪去，室溫反應(yīng)2 h，合成路線見圖1.收集偶聯(lián)后的溶液，裝入相對分子質(zhì)量為12 400的透析袋中，4 ℃攪拌條件下用3 L PBS(0.015 mol·L-1，pH=7.4)緩沖液透析3 d，每天更換透析液2次.透析完成后，離心取上清液，得到的完全抗原分裝于1 mL離心管中，凍存于-20 ℃條件下備用.

包被原AMOZ-OVA偶聯(lián)物的制備方法同免疫原AMOZ-BSA的制備.

1.5 免疫原CPAMOZ-BSA、包被原CPAMOZ-OVA的制備

CPAMOZ的合成與鑒定：稱取100 mg AMOZ于25 mL干燥圓底燒瓶中，用3 mL甲醇溶解，攪拌升溫至60 ℃，再加入156 mg 對醛基苯甲酸，反應(yīng)3 h，反應(yīng)過程中用薄層色譜法(Thin layer chromatography，TLC)跟蹤反應(yīng)進程[展開劑為V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)=9∶1].用甲醇洗滌沉淀，烘干后得到白色粉末即為CPAMOZ.取少量CPAMOZ，用甲醇溶解，經(jīng)ESI-MS質(zhì)譜鑒定.

免疫原CPAMOZ-BSA的合成：取0.01 mmol的CPAMOZ溶解于0.2 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再分別加入0.15 mmol EDC·HCl和0.15 mmoL NHS，室溫攪拌反應(yīng)6 h，得溶液a.取30 mg BSA溶于10 mL PBS(pH=7.4，0.1 mol·L-1)，得溶液b.0～4 ℃攪拌，將溶液a逐滴加入溶液b中，反應(yīng)過夜，合成路線見圖2.透析方法同1.4.

包被原CPAMOZ-OVA偶聯(lián)物的制備方法同免疫原CPAMOZ-BSA的制備.

圖1 以AMOZ作半抗原合成人工抗原的路線圖Fig.1 The synthesized scheme of artificial antigens for AMOZ

圖2 以CPAMOZ作半抗原合成人工抗原的路線圖Fig.2 The synthesized scheme of artificial antigens for CPAMOZ

1.6 免疫原的鑒定

在200～400 nm紫外光區(qū)對等濃度的AMOZ-BSA和CPAMOZ-BSA溶液、BSA溶液、AMOZ和CPAMOZ溶液進行光譜掃描，并測定完全抗原載體蛋白和半抗原最大吸收波長處的吸光度，比較特征吸收峰與吸收曲線，初步鑒定人工抗原是否偶聯(lián)成功.

1.7 動物免疫試驗與抗體測定

1.7.1 動物免疫試驗 取6只5～6周齡的雌性Balb/c小鼠隨機均分為2組，編號I和II組，分別免疫CPAMOZ-BSA和AMOZ-BSA，免疫劑量50 μg/只(以蛋白質(zhì)量計算).首免：免疫原稀釋至1 mg/mL，與100 μL弗氏完全佐劑等量混合(體積比1∶1)，充分乳化，Balb/c小鼠背部皮下4點注射；每隔14 d加強免疫1次，將弗氏完全佐劑換成弗氏不完全佐劑，其余操作同首免.第4次加強免疫7 d后，取鼠尾血在4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min后收集尾血血清，用ELISA和ic-ELISA檢測尾血血清效價及對AMOZ和NPAMOZ的抑制率.

1.7.2 多克隆抗體效價測定 采用ELISA測定血清效價，抗血清D450 nm(P)與相同稀釋度陰性對照血清D450 nm(N)之比P/N>2且P>1.0的最大稀釋度為抗AMOZ的多克隆抗體的效價.取D450 nm為1.0左右的抗體稀釋度進行ic-ELISA試驗，測定多克隆抗體靈敏度.

1.7.3 多克隆抗體靈敏度測定 以CPAMOZ-OVA 和AMOZ-OVA為包被原做ic-ELISA鑒定多克隆抗體特異性.分別以100.000、10.000、5.000、1.000、0.500、0.100、0.010、0.001 ng·mL-1的AMOZ、NPAMOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液和包被抗原競爭與多克隆抗體結(jié)合反應(yīng).以相應(yīng)濃度競爭物抑制時的D450 nm(B)與無競爭物抑制時的D450 nm(B0)的比值(B/B0)為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品不同質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，運用四參數(shù)法擬合曲線，推導(dǎo)出回歸方程，根據(jù)回歸方程式計算出NPAMOZ的IC50，同時比較不同抗體特異性的高低.

1.7.4 交叉反應(yīng)測定 用梯度稀釋的呋喃唑酮、呋喃唑酮代謝物(AOZ)、呋喃西林、呋喃西林代謝物(SEM)、呋喃妥因、呋喃妥因代謝物(AHD)、對硝基苯甲醛、對羧基苯甲醛作為抑制物，用ic-ELISA 測定各抑制物在不同濃度的D450 nm，分別作抑制曲線，根據(jù)擬合曲線計算各藥物的IC50，然后按照公式計算交叉反應(yīng)率(CR)：CR =(NPAMOZ的IC50/其他抑制物的IC50)×100%.

2 結(jié)果與分析

2.1 CPAMOZ的鑒定

CPAMOZ的質(zhì)譜圖見圖3，其理論相對分子質(zhì)量為333.1，從質(zhì)譜圖分析CPAMOZ的[M+H]+為334.2，CPAMOZ的[M-COOH+H+H]+為290.2，都與理論相對分子質(zhì)量相符合.結(jié)果表明CPAMOZ合成成功.

圖3 半抗原CPAMOZ的質(zhì)譜圖Fig.3 The mass spectrum of CPAMOZ

2.2 免疫原的鑒定

由紫外分光光度法鑒定免疫原的合成是否成功.CPAMOZ-BSA的紫外圖譜見圖4，由于CPAMOZ結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)，在紫外區(qū)(波長200～400 nm)有一定吸收峰，圖4中CPAMOZ在291.5 nm處有最大吸收峰.當(dāng)它連接到蛋白質(zhì)載體上時，載體蛋白的紫外吸收特征將發(fā)生改變.因此，圖4中載體蛋白BSA在278 nm處有最大吸收峰，而免疫原CPAMOZ-BSA的最大吸收峰在290.5 nm處，表明偶聯(lián)后吸收峰發(fā)生了漂移，初步判斷CPAMOZ-BSA偶聯(lián)成功.AMOZ-BSA的紫外圖譜見圖5，由于AMOZ分子中無苯環(huán)，因此在紫外區(qū)(波長200～400 nm)的吸收峰較為平坦，但AMOZ與BSA通過戊二醛法偶聯(lián)生成了西佛堿結(jié)構(gòu)，從而偶聯(lián)物AMOZ-BSA(未還原)在265 nm處有明顯吸收峰，但西佛堿結(jié)構(gòu)被NaBH4還原成碳氮單鍵后在紫外區(qū)的吸收峰大大降低，AMOZ-BSA(還原)峰形與BSA的相似(圖5)，在277 nm處有最大吸收峰，由此進一步證明了還原成功.

圖4 CPAMOZ-BSA紫外掃描圖譜Fig.4 Ultraviolet scanning of CPAMOZ-BSA

圖5 AMOZ-BSA紫外掃描圖譜Fig.5 Ultraviolet scanning of AMOZ-BSA

2.3 抗體特異性的測定

2.3.1 效價測定 取4免后的小鼠血清，分別用相應(yīng)的包被原做ELISA試驗，測定不同稀釋度小鼠血清的D450 nm，結(jié)果見圖6.免疫原CPAMOZ-BSA和AMOZ-BSA可誘導(dǎo)Ⅰ組、Ⅱ組小鼠產(chǎn)生抗體，其中Ⅰ組的血清抗體效價比較高，均達(dá)到1∶16×104以上，最高的達(dá)1∶32×104以上；II組的血清效價則普遍相對較低，僅達(dá)到1∶4×104以上.以上現(xiàn)象可能是由于CPAMOZ-BSA間隔臂中的苯環(huán)結(jié)構(gòu)是強勢基團，可刺激機體產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答反應(yīng)，因此產(chǎn)生的抗體效價普遍較高.同理，由于AMOZ-BSA間隔臂是碳直鏈，對機體影響較小，因此誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價偏低.

圖6 ELISA測定I、II組小鼠血清多克隆抗體效價

Fig.6 Determination of the duliton of polyclonal antibodies from group Ⅰ and group Ⅱ by ELISA method

2.3.2 靈敏度測定 將2種鼠血清多克隆抗體與合成的2種包被原進行配對組合，以AMOZ、NPAMOZ為競爭物，用ic-ELISA法測定不同組合IC50，結(jié)果(表1)可見，以AMOZ作為競爭物時，4種組合對AMOZ的IC50>200 ng·mL-1，無明顯抑制.以NPAMOZ為競爭物時，AMOZ-BSA誘導(dǎo)產(chǎn)生的II組抗體對NPAMOZ的IC50>200 ng·mL-1，也無明顯抑制；而CPAMOZ-BSA誘導(dǎo)產(chǎn)生的I組抗體，與同源性包被原CPAMOZ-OVA組合配對時，IC50=11.49 ng·mL-1，與異源性包被原AMOZ-OVA組合配對時，IC50=4.53 ng·mL-1，靈敏度明顯提高.分析對比試驗結(jié)果表明:1)AMOZ作半抗原時相對分子質(zhì)量太小且結(jié)構(gòu)簡單，制備的免疫原AMOZ-BSA無法誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對AMOZ的高特異性抗體;2)CPAMOZ作半抗原時，由于其結(jié)構(gòu)中含有強勢基團苯環(huán)且CPAMOZ與NPAMOZ結(jié)構(gòu)相似，因此刺激機體產(chǎn)生的抗體對NPAMOZ同樣具有特異性;3)Ⅰ組抗體與不同包被原組合的ic-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7)表明，抗體與異源性的包被原配對，能使靈敏度得到較大程度的提升，這可能是由于CPAMOZ-BSA誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體對NPAMOZ識別度比AMOZ高，因此以NPAMOZ為競爭物、AMOZ-OVA為包被原時，NPAMOZ的競爭能力提高，從而IC50降低，靈敏度提高.

表1 ic-ELISA對抗體特異性的測定

1)N：表示無明顯抑制作用，IC50>200 ng·mL-1.

2.4 交叉反應(yīng)率測定

以包被原AMOZ-OVA為基礎(chǔ)，采用ic-ELISA方法測定抗體特異性.結(jié)果(表2)可見,抗體與CPAMOZ、AMOZ、FTD等有交叉反應(yīng)，交叉反應(yīng)率分別為78.6%、1.5%和4.6%，與其他結(jié)構(gòu)相近的藥物及其代謝物等基本無交叉反應(yīng).

B0為無競爭物抑制時的D450 nm,B為相應(yīng)濃度競爭物抑制時的D450 nm.

圖7 多克隆抗體與不同包被原組合的ic-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.7 The standard curves of ic-ELISA about different anti-body/coat antigen combinations

表2 抗體與其他藥物的交叉反應(yīng)

3 討論與結(jié)論

AMOZ的相對分子質(zhì)量僅為201，屬于小分子化合物，只具有反應(yīng)原性而不具有免疫原性，因此必須與大分子載體物質(zhì)偶聯(lián).本研究為探討AMOZ分子直接與載體蛋白BSA偶聯(lián)是否可誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生針對AMOZ的特異性抗體，將AMOZ與BSA通過戊二醛法偶聯(lián)，雖然戊二醛法較為常見[9-10]，但其生成物的間隔臂較長且含有西佛堿結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差，本文通過NaHB4將西佛堿結(jié)構(gòu)還原使生成物轉(zhuǎn)變成更穩(wěn)定的免疫原AMOZ-BSA.另外，又以AMOZ與對醛基苯甲酸反應(yīng)合成CPAMOZ，通過活性酯法將CPAMOZ與BSA偶聯(lián)得免疫原CPAMOZ-BSA[11].免疫原AMOZ-BSA與CPAMOZ-BSA的結(jié)構(gòu)區(qū)別主要在于間隔臂的立體結(jié)構(gòu)是否復(fù)雜.本試驗采用2種包被原通過ic-ELISA方法對2種免疫原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體的特性進行測定，對比兩者結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以AMOZ為競爭物時，無論采用同源性或者異源性包被方式，ic-ELISA的IC50>200 ng·mL-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到中國零殘留檢測的要求和歐盟的要求[12].據(jù)分析導(dǎo)致抑制率差是由于AMOZ相對分子質(zhì)量太小且立體結(jié)構(gòu)不夠復(fù)雜，無法刺激動物機體產(chǎn)生對AMOZ有高特異性的抗體.然而CPAMOZ-BSA結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)較為復(fù)雜，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生對NPAMOZ的特異性抗體，并且通過與異源性包被原AMOZ-BSA配對，測得I組鼠血清多克隆抗體效價為1∶32×104，IC50=4.53 ng·mL-1，靈敏度比同源性配對法高2倍多,表明抗原抗體的異源性配對能提高ELISA方法的靈敏度，這與已有的文獻(xiàn)[13]報道相符.從而為其單克隆抗體的制備和ic-ELISA方法靈敏度的提高建立了良好的基礎(chǔ)，并且這也為環(huán)境、食品中殘留農(nóng)藥的快速檢測提供一定的參考.

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【責(zé)任編輯柴 焰】

Synthesisofartificialantigensandpreparationforspecificantiseraagainst3-amino-2-oxazolidinone，ametaboliteoffuraltadone

SHU Jianhua，GUO Hongyan，WANG Liqi，GAO Yan，ZENG Zhenling

(College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

【Objective】To establish a high sensitivity enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of furaltadone.【Method】Furaltadone metabolite (3-amino-5-morpholinomethyl- 2-oxazolidinone, AMOZ) was coupled to carrier proteins (bovine serum albumin or ovalbumin) and reduced with NaBH4for the production of immunogen AMOZ-BSA and coating antigen AMOZ-OVA through glutaraldehyde method. With 4-carboxybenzaldehyde for derivatization reagent, AMOZ was made into CPAMOZ, which was successfully conjugated to carrier proteins according to the active ester method to form CPAMOZ-BSA, CPAMOZ-OVA. UV scanning showed that antigens were successfully linked to carrier proteins. After immunizing animal (Balb/c mice), polyclonal antibody against NPAMOZ was produced. 【Result and conclusion】 Antibody was diluted at 1∶32×104and the IC50value was 4.53 ng·mL-1. The cross-reactivity (CR) of the antibody with CPAMOZ, AMOZ and furaltadone was 78.6%, 1.5% and 4.6% respectively. There is almost no CR with other three nitrofurans and their metabolites, which indicates a high selectivity of the antibody.

furaltadone metabolite; hapten； polyoclonal antibody; enzyme-linked immunosorbent assay

2013- 05- 31優(yōu)先出版時間2014- 01- 03

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20140103.0830.022.html

束建花 (1988—)，女，碩士研究生，E-mail: 386126805@qq.com；通信作者：曾振靈 (1963—)，男，教授，博士，E-mail: zlzeng@scau.edu.cn

農(nóng)業(yè)部獸藥質(zhì)量安全監(jiān)管項目(農(nóng)財發(fā)[2012]36號)

束建花，郭紅艷，王立琦，等.呋喃它酮代謝物人工抗原的合成及抗體的制備[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014,35(2):18- 23.

S511； S502

A

1001- 411X(2014)02- 0018- 06