孫高潔,王 姣,崔 巖,王守俊

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 450052

β3腎上腺素能受體激動劑對小鼠脂肪細胞中UCP1和磷酸化p38蛋白表達的影響

孫高潔,王 姣,崔 巖,王守俊#

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 450052

#通訊作者，男，1967年11月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向：2型糖尿病的發(fā)病機制和防治，E-mail:wangshoujun02@126.com

β3腎上腺素能受體激動劑；脂肪細胞;解偶聯(lián)蛋白1;p38/MAPK通路；小鼠

目的：探討β3腎上腺素能受體激動劑CL-316243對脂肪細胞中解偶連蛋白1(UCP1)表達的影響。方法將3T3-L1前脂肪細胞誘導(dǎo)成為脂肪細胞，隨機分為4組，分別采用常規(guī)培養(yǎng)基(空白對照組)、10 μmol/L p38/MAPK抑制劑SB203580(SB203580組)、10-7mol/L β3腎上腺素能受體激動劑CL-316243聯(lián)合10 μmol/L SB203580(CL-316243+SB203580組)、10-7mol/L CL-316243(CL-316243組)處理。48 h后，RT-PCR法檢測4組細胞中UCP1 mRNA表達水平，Western blot法檢測空白對照組、CL-316243+SB203580組和CL-316243組細胞中p38蛋白磷酸化程度。結(jié)果CL-316243組、空白對照組、SB203580組和CL-316243+SB203580組細胞中UCP1 mRNA的表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(FCL-316243=204.043,FSB203580=151.736,F交互=143.308,P<0.001)，CL-316243組表達水平較其他3組明顯增高(P<0.05)。CL-316243組細胞中p38蛋白磷酸化程度較空白對照組和CL-316243+SB203580組升高(F=137.339,P<0.001)，后2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論CL-316243可能通過激活p38/MAPK信號通路，促進脂肪細胞中UCP1的表達。

隨著人們生活方式的改變和生活水平的提高，肥胖癥和2型糖尿病的發(fā)病率逐年升高。人體內(nèi)有兩種脂肪組織，即白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)和棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)，WAT與BAT在能量代謝中發(fā)揮著截然相反的作用,WAT主要通過甘油三酯貯存能量, 而BAT則消耗能量[1]，高水平的BAT有助于減輕體重和維持機體血糖穩(wěn)態(tài)[2-3]。因此促使WAT向BAT轉(zhuǎn)化可能是一個治療肥胖癥比較有效的方法。目前研究[4]發(fā)現(xiàn),β3腎上腺素能受體激動劑可刺激WAT的脂解，也可誘導(dǎo)WAT向BAT的轉(zhuǎn)化。解偶聯(lián)蛋白1(unconpling protein 1,UCP1)是一種在BAT中特異表達的線粒體內(nèi)膜蛋白質(zhì),是決定棕色脂肪組織功能的關(guān)鍵因素[5-6]，因此，它可成為一個衡量WAT向BAT轉(zhuǎn)化的特異性指標(biāo)。作者觀察了選擇性β3腎上腺素能受體激動劑CL-316243對小鼠脂肪細胞中UCP1和p38/MAPK信號通路蛋白表達的影響，探討β3腎上腺素能受體激動劑對WAT棕色化的影響及作用機制，為肥胖癥、糖尿病等相關(guān)代謝性疾病的診治提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1細胞來源和主要試劑小鼠前脂肪細胞株3T3-L1細胞購自武漢博士德公司。地塞米松(dexamethasone，Dex)、胰島素、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(1-methyl-3-isobuthylxanthine，IBMX)和CL-316243均購自Santa Cruz公司；Trizol試劑購自TaKaRa公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR Master Mix購自北京全式金公司;p38 MAPK抑制劑SB203580、p38抗體、磷酸化p38(p-p38)抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2細胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)成熟將3T3-L1前脂肪細胞接種于含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2條件下培養(yǎng)，待細胞生長至完全融合后換用含1 μmol/L Dex、0.5 μmol/L胰島素、0.5 mmol/L IBMX的DMEM高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，3 d后換用含1 μmol/L Dex、0.5 μmol/L胰島素的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液1次，至第10天，約90%的細胞呈脂肪細胞表型，經(jīng)油紅O染色鑒定，證實為脂肪細胞。

1.3實驗分組細胞分化成熟后，隨機分為4組，分別采用常規(guī)培養(yǎng)基(空白對照組)、10 μmol/L SB203580(SB203580組)、10-7mol/L CL-316243聯(lián)合10 μmol/L SB203580(CL-316243+SB203580組)、10-7mol/L CL-316243(CL-316243組)處理。

1.4細胞中UCP1mRNA的檢測細胞處理48 h后，采用RT-PCR法檢測UCP1 mRNA。根據(jù)GenBank中的UCP1(NM_009463.3)和內(nèi)參β-actin(NM_007393)基因序列設(shè)計引物， UCP1基因引物由寶生物公司合成，內(nèi)參β-actin引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。UCP1引物序列：上游5’-CACTCAGGATTGGCCTCTACGAC-3’，下游5’-GCTCTGGGCTTGCATTCTGAC-3’；β-actin引物序列：上游5’-GTCCCTCACCTCCCAAAA-3’，下游5’-GCT GCCTCAACACCTCAACCC-3’。用Trizol試劑提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以其為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，55.7 ℃(UCP1)或64.5 ℃(β-actin)退火30 s，72 ℃延伸20 s，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用UVP公司的VisionWorks LS軟件進行分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的基因mRNA的表達水平。

1.5細胞中p-p38蛋白的檢測收集空白對照組、SB203580組和CL-316243+SB203580組處理48 h的細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，采用Western blot檢測p38、p-p38蛋白。SDS-PAGE膠上每泳道上樣37.5 μg蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗均稀釋1 000倍，搖床4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5 min×3次，加HRP標(biāo)記的二抗(稀釋1 000倍)孵育1 h，洗滌3次后DAB顯色。用UVP公司的VisionWorks LS軟件進行分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的表達水平。以p-p38/p38×100%表示p38磷酸化的程度。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，4組間UCP1 mRNA表達水平的比較采用2×2析因設(shè)計的方差分析,3組間p38磷酸化程度的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1油紅O染色鑒定結(jié)果見圖1。

圖1 貼壁后(A)及分化后(B，油紅O染色)細胞的形態(tài)觀察(×100)

2.2 4組脂肪細胞中UCP1mRNA表達水平的比較見圖2及表1。CL-316243組細胞中UCP1 mRNA的表達水平較空白對照組、SB203580組和CL-316243+SB203580組明顯升高(P<0.05)。

2.3空白對照組、CL-316243+SB203580組和CL-316243組脂肪細胞中p38磷酸化程度的比較見圖3和表2。CL-316243組細胞中p38磷酸化程度較空白對照組、CL-316243+SB203580組明顯升高；后2組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 4組脂肪細胞中UCP1 mRNA的表達

A:空白對照組；B：SB203580組；C:CL-316243+SB203580組；D:CL-316243組。

表1 4組細胞中UCP1 mRNA表達水平的比較(n=3)

FCL-316243=204.043,FSB203580=151.736,F交互=143.308,P<0.001。

圖3 3組細胞中p-p38蛋白的表達

A:空白對照組；C：CL-316243+SB203580組；D:CL-316243組。

表2 3組細胞中p38磷酸化程度的比較

F=137.339,P<0.001;*:與其他2組比較，P<0.05。

3 討論

β3 腎上腺素能受體主要調(diào)節(jié)機體的脂肪分解和產(chǎn)熱過程，它被激活后可上調(diào)UCP1的表達,從而誘導(dǎo)WAT的棕色化[7]。已有文獻[8]指出，去甲腎上腺素刺激β3腎上腺素能受體后可激活cAMP-PKA通路，引起UCP1快速調(diào)節(jié)物(如FFA)的釋放，也可激活p38/MAPK通路，從而上調(diào)UCP1的表達。

該研究結(jié)果顯示，CL-316243組細胞中UCP1mRNA表達水平和p38磷酸化程度均較空白對照組明顯升高,說明CL-316243可促進脂肪細胞中UCP1的表達和p38的磷酸化，激活p38/MAPK信號傳導(dǎo)通路；SB203580組細胞UCP1 mRNA表達水平與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明p38抑制劑本身并不會影響脂肪細胞中UCP1的表達；CL-316243組細胞中UCP1 mRNA表達水平和p38磷酸化程度均高于CL-316243+SB203580組，說明p38抑制劑SB203580確實抑制了p38的磷酸化，而之前已驗證p38抑制劑SB203580本身并不會影響UCP1的表達，所以p38/MAPK信號通路可能參與了CL-316243誘導(dǎo)UCP1表達的過程。

因此，可以看出，β3腎上腺素能受體激動劑在誘導(dǎo)WAT棕色化過程中發(fā)揮了一定的作用，這就為臨床上研究新型高效能的抗肥胖和糖尿病藥物提供了新的實驗依據(jù)。

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(2013-11-07收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effect of β3-adrenoceptor agonist on expression of UCP1 and phosphorylated p38 in mouse adipocytes

SUNGaojie，WANGJiao，CUIYan，WANGShoujun

DepartmentofEndocrinology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

β3-adrenoceptor agonist;adipocyte;uncoupling protein 1;p38/MAPK;mouse

Aim: To investigate the effect of β3-adrenoceptor agonist CL-316243 on expression of uncoupling protein 1(UCP1) in mouse adipocytes. Methods: 3T3-L1 preadipocytes were induced into adipocytes,then the adipocytes were divided into four groups:blank control group, p38/MAPK inhibitor SB203580 group,10-7mol/L CL-316243 combined with SB203580 group,10-7mol/L CL-316243 group.The adipocytes were treated with these regents for 48 h,then the expression level of UCP1 mRNA was evaluated by RT-PCR,and the phosphorylated p38(p-p38) was evaluated by Western blot. Results: The expression level of UCP1 mRNA in CL-316243 group was higher than those in the other 3 groups(FCL-316243=204.043,FSB203580=151.736,Finteraction=143.308,P<0.001).The p-p38 expression in CL-316243 group was higher than those in the blank control group and CL-316243 + SB203580 group(F=137.339,P<0.001)，but those in the other 2 groups had no statistical significance(P>0.05).Conclusion: β3-adrenoceptor agonist CL-316243 can promote the expression level of UCP1 in adipocytes through activating p38/MAPK signaling pathway.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.012

R589.2