龍麗坤， 韓 月， 楊丹丹， 閆 偉， 李飛武*

1吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物技術研究所，吉林 長春130033； 2哈爾濱師范大學生命科學與技術學院，黑龍江 哈爾濱 150025

除草劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上對田間雜草的防治具有十分重要的作用，根據(jù)其作用方式可分為選擇性除草劑和滅生性除草劑(陳海偉等，2012)。隨著除草劑抗性基因的發(fā)現(xiàn)并將其通過遺傳工程手段導入主要農(nóng)作物中，抗除草劑轉基因作物取得了重大發(fā)展，是當前應用面積最廣的轉基因作物類型。2013年全球種植的抗除草劑轉基因作物(包括抗蟲抗除草劑復合性狀)超過1.46億hm2，占轉基因作物種植總面積的83.6%，其中具有草甘膦抗性和草銨膦抗性的轉基因作物占絕大多數(shù)，這2類轉基因作物的應用可確保在整個生長季使用滅生性除草劑控制田間雜草而不會對作物造成傷害，有效降低了雜草的控制成本(James，2014)。近年來，一些新的除草劑抗性基因被相繼發(fā)掘和應用到轉基因作物中，使得除草劑的使用更具靈活性。

轉基因技術的快速發(fā)展給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來諸多有利因素，但作為一項在農(nóng)業(yè)領域應用不到20年的新興技術，社會公眾對其認知度和接受程度還有待提高，圍繞轉基因生物及其產(chǎn)品是否安全的討論在社會層面廣泛存在(劉培磊等，2011)。鑒于此，許多國家根據(jù)各自國情，制定了轉基因生物安全管理法律法規(guī)，其中50多個國家和地區(qū)建立了標識制度，要求對轉基因產(chǎn)品實行定性或定量標識，以滿足社會公眾的知情權和選擇權(王榮談等，2013)。而轉基因產(chǎn)品標識制度及市場監(jiān)管工作的實施，需要快速、靈敏、準確的檢測技術作為支撐。

按照檢測靶標對象不同，可將轉基因產(chǎn)品的檢測技術劃分為兩大類：一類是以轉入的外源DNA(如外源目的基因、表達調(diào)控元件、載體序列等)作為檢測對象，這類技術包括常規(guī)PCR、實時熒光定量PCR、基因芯片等；另一類是以轉入的外源目的基因或標記基因表達的蛋白質作為檢測對象，如ELISA、快速檢測試紙條、蛋白質芯片等(Zhang & Guo，2011)。PCR技術由于適用性廣、靈敏度高，是目前國內(nèi)外廣泛應用的轉基因產(chǎn)品檢測技術，根據(jù)不同原理，PCR技術又能細分為定性PCR、定量PCR、多重PCR、巢式PCR、數(shù)字PCR等(鄧漢超等，2011)。我國目前對轉基因產(chǎn)品實行定性標識管理，在監(jiān)管工作中主要采用定性PCR檢測方法，已建立了針對CaMV35S啟動子、NOS終止子等調(diào)控元件(謝家建等，2012)，針對除草劑抗性基因cp4-epsps、bar(Guoetal.,2012)、抗蟲基因Bt(李飛武等，2014)、CpTI(朱珠等，2012)等外源目的基因，以及針對MON88017玉米(瞿勇等，2010)、59122玉米(Xuetal.,2009)等轉化事件的PCR檢測方法，但未見除草劑抗性基因aad1 和dmo的PCR檢測方法的報道。

本研究以在轉基因作物中進行商業(yè)化應用的2種新的除草劑抗性基因aad1 和dmo為對象，開展PCR檢測體系、方法特異性、靈敏度、穩(wěn)健性等測試，旨在建立針對這2種外源目的基因的特異性PCR檢測方法，為轉基因作物的安全監(jiān)管提供切實可行的技術手段。

1 材料與方法

1.1 植物試驗材料

轉aad1 基因玉米DAS40278-9(ERM-BF433d)、轉cp4-epsps基因玉米NK603(ERM-BF415f)、轉cry1Ab和pat基因玉米Bt11(ERM-BF412f)、轉cry34Ab、cry35Ab和pat基因玉米59122(ERM-BF424d)轉mcry3A和pmi基因玉米MIR604(ERM-BF423d)購自歐洲標準物質與測量研究所(IRMM)，轉dmo基因大豆MON87708由孟山都公司研發(fā)和饋贈，非轉基因玉米、大豆為本實驗室收集保存的樣品。

1.2 基因組DNA提取

應用植物基因組DNA提取試劑盒(DP320)[天根生化科技(北京)有限公司]提取樣品基因組DNA，操作步驟按試劑盒使用說明執(zhí)行，提取的DNA用ND1000核酸微量分光光度計(美國Thermo Fisher)測定濃度和純度，并用試劑盒附帶的DNA稀釋緩沖液稀釋至25 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR反應

單一PCR：在200 μL的PCR反應管中依次加入10×PCR緩沖液2.5 μL，2.5 mmol·L-1的dNTPs混合溶液2 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，5 U·μL-1熱啟動rTaq DNA聚合酶0.125 μL，基因組DNA溶液2 μL，加超純水至25 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；35個循環(huán)(94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)；72 ℃延伸5 min。

雙重PCR：除加入2對0.5 μL引物，并相應調(diào)整超純水的用量至PCR體系總體積為25 μL外，其他組分的用量及PCR反應程序與單一PCR相同。

電泳檢測：PCR擴增結束后，取 10 μL擴增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 除草劑抗性基因的核苷酸序列分析及引物設計與篩選

根據(jù)研發(fā)人公開的國內(nèi)外專利信息(Brinkeretal.,2013； Cuietal.,2012)，使用生物信息學軟件Vector NTI Advance?11.5進行序列比對分析，獲得了DAS40278-9玉米中的aad1 基因(1005 bp)和MON87708大豆中的dmo基因(1275 bp)的核苷酸序列。以這2個基因的序列為模板，應用Primer Premier 5.0設計了一系列PCR檢測引物，經(jīng)過試驗驗證確定的檢測引物相關信息見表1。為保證所設計引物序列的特異性，將設計的引物序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(http:∥blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行核苷酸序列檢索，結果顯示，引物序列與主要農(nóng)作物均不具有同源性，從理論上保證了引物在轉基因作物檢測中的特異性。

表1 PCR檢測引物信息Table 1 Information of the PCR primers

2.2 單一PCR檢測方法的特異性測試

以DAS40278-9玉米、NK603玉米、Bt11玉米、59122玉米、MIR604玉米、MON87708大豆等6種轉基因作物以及非轉基因玉米和大豆為測試樣品，對aad1 基因和dmo基因的檢測方法進行特異性測試。PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖譜見圖1和圖2，在aad1 基因檢測體系中僅DAS40278-9玉米樣品出現(xiàn)特異性條帶，dmo基因檢測體系中僅MON87708大豆樣品出現(xiàn)特異性條帶，其他測試樣品和空白對照在2種檢測體系中均未出現(xiàn)特異性產(chǎn)物，表明本研究建立的2種除草劑基因的PCR檢測方法對靶標基因具有高度特異性。

2.3 單一PCR檢測方法的靈敏度測試

提取DAS40278-9玉米的基因組DNA，用0.1×TE緩沖液對其進行梯度稀釋，獲得質量濃度為250、125、25、12.5、2.5 pg·μL-1的5份樣品，取2 μL作為模板，利用aad1 基因的PCR檢測方法進行測試，以判定方法的靈敏度。采用同樣的制樣方法，獲得MON87708大豆基因組DNA質量濃度為250、125、25、12.5、2.5 pg·μL-1的5份樣品，用于dmo基因的PCR檢測方法的靈敏度測試。結果如圖3和圖4所示，2個基因的PCR檢測方法均可以從25 pg·μL-1及以上濃度的樣品中獲得與預期大小一致的擴增產(chǎn)物，表明本研究建立的aad1 基因和dmo基因的PCR檢測方法的檢出限均可達到50 pg，按照玉米和大豆的基因組DNA大小進行估算(Arumuganathan & Earle，1991)，2種方法的絕對檢出限分別約為20個拷貝和40個拷貝，具有良好的靈敏度。

圖1 aad1 基因PCR檢測方法的特異性Fig.1 Specificity of PCR method for detecting aad1 gene M：DL2000 DNAMarker；1：空白對照；2：DAS40278-9；3：NK603；4：Bt11；5：59122；6：MIR604；7：MON87708；8：非轉基因玉米和大豆混樣。 M： DL2000 DNA Marker; 1： blank control; 2: DAS40278-9; 3: NK603; 4: Bt11; 5: 59122; 6: MIR604; 7: MON87708; 8: non-GM maize and soybean mix.

2.4 PCR檢測體系的穩(wěn)健性

為測試aad1 基因和dmo基因PCR檢測方法對不同退火溫度的適應度，對每種基因的PCR檢測體系均設置56、58、60、62、64 ℃等5個退火溫度，進行PCR方法的穩(wěn)健性測試。PCR擴增結果見圖5，2個基因的PCR檢測體系在5種退火溫度條件下，均能獲得與預期一致的PCR產(chǎn)物，表明2種基因的PCR檢測方法對退火溫度有較寬的適合度，具有良好的適用性。

圖2 dmo基因PCR檢測方法的特異性Fig.2 Specificity of PCR method for detecting dmo gene M:DL2000 DNA Marker；1：空白對照；2：MON87708；3：NK603；4：Bt11；5：59122；6：MIR604；7：DAS40278-9；8：非轉基因玉米和大豆混樣。 M： DL2000 DNA Marker; 1： blank control; 2： MON87708; 3： NK603; 4： Bt11; 5： 59122; 6： MIR604; 7： DAS40278-9; 8： non-GM maize and soybean mix.

圖3 aad1 基因PCR檢測方法的靈敏度Fig.3 Sensitivity of PCR method for detecting aad1 gene M：DL2000 DNA Marker；1：空白對照；2：非轉基因玉米和大豆混樣；3～7分別代表質量濃度為250、125、25、12.5、2.5 pg·μL-1的DAS40278-9玉米基因組DNA樣品。 M： DL2000 DNA Marker; 1： blank control; 2： non-GM maize and soybean mix; 3～7: 250, 125, 25, 12.5 and 2.5 pg·μL-1 of DAS40278-9 maize genomic DNA, respectively.

圖4 dmo基因PCR檢測方法的靈敏度Fig.4 Sensitivity of PCR method for detecting dmo gene M：DL2000 DNA Marker；1：空白對照；2：非轉基因玉米和大豆混樣；3～7分別代表質量濃度為 250、125、25、12.5、2.5 pg·μL-1的MON87708大豆基因組DNA樣品。 M： DL2000 DNA Marker; 1： blank control; 2： non-GM maize and soybean mix; 3～7: 250, 125, 25, 12.5 and 2.5 pg·μL-1 of MON87708 soybean genomic DNA, respectively.

圖5 PCR檢測方法的穩(wěn)健性Fig.5 Robustness of PCR method M：DL2000 DNA Marker；1：空白對照；2：非轉基因玉米和大豆混樣；3～7分別代表退火溫度為56、58、60、62、64 ℃。 M： DL2000 DNA Marker; 1： blank control; 2： non-GM maize and soybean mix; 3～7: annealing with 56, 58, 60, 62 and 64 ℃, respectively.

2.5 雙重PCR檢測體系的建立

本研究將aad1 基因和dmo基因的PCR檢測引物放到同一個反應體系中，旨在建立能同時檢測這2個靶標基因的雙重PCR檢測方法。將DAS40278-9玉米的基因組DNA和MON87708大豆的基因組DNA等量混合，并用0.1×TE緩沖液對混合DNA樣品進行梯度稀釋，獲得DAS40278-9玉米基因組DNA和MON87708大豆基因組DNA的質量濃度均為250、125、25、12.5、2.5 pg·μL-1的5份樣品，對雙重PCR檢測體系進行測試。結果如圖6所示，利用雙重PCR檢測體系，可獲得與單一PCR檢測體系相同的檢測靈敏度，雙重PCR檢測體系中aad1 基因和dmo基因的檢出限分別可達到約20個拷貝和40個拷貝。

圖6 雙重PCR檢測方法的靈敏度Fig.6 Sensitivity of the duplex PCR for detecting aad1 and dmo gene M：DL2000 DNA Marker；1：空白對照；2：非轉基因玉米和大豆混樣；3～7分別代表質量濃度各為250、125、25、 12.5、2.5 pg·μL-1的DAS40278-9玉米和MON87708大豆基因組DNA混樣。 M： DL2000 DNA Marker; 1： blank control; 2： non-GM maize and soybean mix; 3～7: 250, 125, 25, 12.5 and 2.5 pg·μL-1 of DAS40278-9 maize and MON87708 soybean genomic DNA mix, respectively.

3 討論

將除草劑抗性基因導入作物后，可使后者擁有抗除草劑的特性，這為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應用除草劑防治雜草提供了便利(李云河等，2012)。通過查詢國內(nèi)外有關數(shù)據(jù)庫，目前在生產(chǎn)上應用的除草劑抗性基因主要為cp4-epsps、bar、aad1、dmo等，其中cp4-epsps基因和bar基因在轉基因作物商業(yè)化初期就已投入應用，是目前使用頻次最高的2類除草劑抗性基因(陳海偉等，2012)，aad1 基因和dmo基因自2011年開始在商業(yè)化轉基因作物中出現(xiàn)并已有多種轉化體進入中國市場。因此，以除草劑抗性基因為靶標對象的特異性檢測方法是轉基因產(chǎn)品日常監(jiān)管和篩選檢測的重要技術手段之一。

由于cp4-epsps基因和bar基因在轉基因作物中已被廣泛長期應用，針對這2個基因的PCR檢測方法已有諸多報道，并形成相應的國家標準(路興波等，2012； 楊立桃等，2012)。然而，aad1 基因和dmo基因是近幾年來才被應用于轉基因作物，而且含有這2個基因的轉化體才開始向我國提交進口申請，目前還未見關于aad1 基因和dmo基因的PCR檢測方法的報道。本研究通過查詢國內(nèi)外專利信息，獲得了這2個基因的核苷酸序列，并根據(jù)該序列建立了特異性檢測這2個基因的PCR檢測方法，檢出限可達到20個拷貝(aad1 )和40個拷貝(dmo)，能夠滿足日常監(jiān)管工作的需要，該方法的相關技術指標已達到同類檢測方法的水平(Guoetal.,2012)。

在一個PCR體系中同時檢測多種轉基因成分可提高檢測效率、降低檢測成本(王渭霞等，2009)。本研究將aad1 基因和dmo基因的檢測引物放在同一個PCR反應管中進行檢測，建立了能在一個PCR管中同時檢測這2個目的基因的雙重PCR方法，檢測靈敏度達到與單一PCR方法相同的水平，具有較好的應用前景。

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