劉 標(biāo)， 方志翔， 鄭央萍， 徐文華

1環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所生物安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210042； 2江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 鹽城 224002

轉(zhuǎn)Bt基因作物因其高效殺蟲性而被廣泛應(yīng)用，已經(jīng)在全世界推廣種植長(zhǎng)達(dá)近20年之久。但是，隨著Bt作物種植時(shí)間的延長(zhǎng)以及關(guān)于害蟲Bt抗性研究的深入，越來(lái)越多的科學(xué)家開始關(guān)注田間靶標(biāo)害蟲對(duì)Bt作物產(chǎn)生抗性風(fēng)險(xiǎn)的問(wèn)題。多方面研究已經(jīng)證實(shí)了害蟲對(duì)Bt作物產(chǎn)生抗性的潛在風(fēng)險(xiǎn)(Ferré & Van Rie,2002; Griffitts & Aroian,2005； Mengetal.,2004; Tabashnik,1994)。因此，針對(duì)靶標(biāo)害蟲對(duì)轉(zhuǎn)Bt作物抗性檢測(cè)和監(jiān)測(cè)顯得尤為重要。棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHübner是轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉的靶標(biāo)害蟲，有關(guān)河北、河南、山東、山西等地的棉鈴蟲抗性已有較多研究(何丹軍等,2001； Wu,2007)，但是，關(guān)于長(zhǎng)江中下游地區(qū)棉鈴蟲的抗性變化情況尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究選擇我國(guó)長(zhǎng)江流域鹽城棉區(qū)為試驗(yàn)地，開展了田間棉鈴蟲種群對(duì)Bt毒素抗性基因頻率的監(jiān)測(cè)工作，以期為轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉花的長(zhǎng)期發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試蟲采集及飼養(yǎng)

于2012年8月(第3代棉鈴蟲盛發(fā)期)，在江蘇鹽城市三龍鎮(zhèn)和東臺(tái)鎮(zhèn)棉花種植區(qū)內(nèi)隨機(jī)采集500余頭棉鈴蟲4齡幼蟲，帶回實(shí)驗(yàn)室放入培養(yǎng)皿中，在室內(nèi)溫度(27±1) ℃、光周期L∶D=14 h∶10 h、相對(duì)濕度75%～85%的條件下用人工飼料飼養(yǎng)至化蛹并羽化。然后將羽化后的成蟲放入一次性塑料杯內(nèi)單對(duì)交配(同一棉區(qū)1頭雌成蟲與1頭雄成蟲交配)，每個(gè)單對(duì)編號(hào)，收集每個(gè)單對(duì)的有效卵，每個(gè)單對(duì)獨(dú)立孵化飼養(yǎng)。取部分初孵棉鈴蟲幼蟲用于測(cè)定其對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的敏感性，其余幼蟲用人工飼料飼養(yǎng)至2齡初期，體重1 mg左右，用于測(cè)定其對(duì)Bt蛋白的抗性基因頻率。

1.2 供試棉

供試棉分別為由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所研制的中棉系列中16和由山東省棉花研究中心研制的魯棉系列轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉中30。

1.3 供試毒蛋白

Bt(CrylAc)活化毒素購(gòu)自美國(guó)Case Western Reserve University。將活化后的Bt毒素溶于0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)，配成0.1 μg·μL-1的毒蛋白溶液；對(duì)照組試劑(CK)為pH 7.4、0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液。

1.4 轉(zhuǎn)Bt基因棉花對(duì)棉鈴蟲死亡率和體重的影響

把濕潤(rùn)的濾紙放入培養(yǎng)皿中，每皿接初孵棉鈴蟲幼蟲5頭后分別飼喂轉(zhuǎn)Bt基因棉花(中30)及其對(duì)照非轉(zhuǎn)基因棉花(中16)的幼嫩葉片。接蟲后用紗布封嚴(yán)培養(yǎng)皿，防止幼蟲逃逸和保持皿內(nèi)濕度，置于(26±1) ℃、L∶D=14 h∶10 h的養(yǎng)蟲室內(nèi)。試驗(yàn)設(shè)5個(gè)重復(fù)。每天更換新鮮的棉花葉片，并調(diào)查各處理幼蟲死亡情況，計(jì)算死亡率，用分析天平精確稱量各處理組存活幼蟲的體重。

1.5 棉鈴蟲幼蟲對(duì)Bt蛋白的抗性基因頻率

區(qū)分劑量法是在生物測(cè)定的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，其原理是用殺死99%敏感個(gè)體的劑量作為診斷劑量，在此濃度下存活的個(gè)體為抗性個(gè)體，反之則為非抗性個(gè)體。根據(jù)陳海燕等(2007)的方法，棉鈴蟲2齡初期幼蟲對(duì)活化Cry1Ac毒素的區(qū)分劑量為10 μg·頭-1。具體操作步驟：(1)取已冷卻凝結(jié)的棉鈴蟲人工飼料，以切片器將之切成3 mm厚的薄片；然后用打孔器打成圓片狀，用鑷子放入24孔培養(yǎng)板底部。(2)將24孔培養(yǎng)板每個(gè)孔中的飼料壓實(shí)，并將孔口和孔壁等可能沾有飼料的地方清理干凈。(3)將100 μL 0.1 μg·μL CrylAc活化毒素加入每個(gè)孔，培養(yǎng)板數(shù)量以供試幼蟲數(shù)量而定。取一個(gè)24孔培養(yǎng)板作對(duì)照，只加入100 μL磷酸鹽緩沖液。(4)待24孔培養(yǎng)板飼料表面的溶液晾干后，每孔接入上述1.1中獲得的1頭體重約1 mg左右的2齡初期幼蟲，用2層尼龍紗和1層黑布覆蓋防止其逃跑。置于恒溫光照培養(yǎng)箱(26±1) ℃、L∶D=14 h∶10 h、相對(duì)濕度75%～85%條件下，5 d后檢查幼蟲的死亡狀況。完全死亡或生長(zhǎng)發(fā)育受到限制(體重小于5 mg)均視為死亡。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)Bt基因棉花對(duì)棉鈴蟲死亡率和體重的影響

由表1可見(jiàn)，初孵棉鈴蟲幼蟲取食轉(zhuǎn)Bt基因棉花幼嫩葉片之后，在9 d之內(nèi)全部死亡，而取食非轉(zhuǎn)基因棉花葉片的初孵棉鈴蟲幼蟲在9 d之內(nèi)絕大多數(shù)存活，且生長(zhǎng)發(fā)育正常。這說(shuō)明目前鹽城棉鈴蟲田間種群對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉仍保持很高的敏感性。

2.2 鹽城田間棉鈴蟲種群對(duì)Bt蛋白的抗性基因頻率

三龍鎮(zhèn)和東臺(tái)鎮(zhèn)的受試總蟲數(shù)分別為397和448頭。2齡幼蟲經(jīng)區(qū)分劑量處理5 d后，絕大多數(shù)死亡，兩地的死亡蟲數(shù)分別為394和445頭，由此計(jì)算出三龍鎮(zhèn)和東臺(tái)鎮(zhèn)的田間棉鈴蟲種群對(duì)Bt蛋白的抗性基因頻率分別為7.6×10-3和6.9×10-3。

表1 初孵棉鈴蟲取食不同棉葉后的死亡率和體重Table 1 Mortality and body mass of the newly hatched larvae of the cotton bollworm exposed to different cotton leaves

數(shù)據(jù)為5個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，同列數(shù)據(jù)后附不同大寫字母者表示不同品種間差異極顯著(P<0.01)。

Datas are means±SD, the same column followed by different capital letters show very significant differences between different cottons.

3 結(jié)論與討論

轉(zhuǎn)Bt基因棉長(zhǎng)期大量種植，造成的潛在風(fēng)險(xiǎn)之一是靶標(biāo)害蟲對(duì)Bt棉的抗性進(jìn)化，這將嚴(yán)重威脅Bt棉的持續(xù)有效應(yīng)用。靶標(biāo)害蟲對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因作物的抗性進(jìn)化依賴于多種因素，包括靶標(biāo)害蟲種群中抗性等位基因的初始頻率、害蟲抗性遺傳模式、抗性的顯隱性度及適合度、害蟲在不同寄主上的時(shí)空分布情況以及不同地理種群間的基因流等(Gould,1998; McGaughey & Whalon,1992; Tabashnik,1994)?？剐员O(jiān)測(cè)是了解害蟲抗性發(fā)展的有效途徑，能夠?yàn)榉乐慰剐院οx種群提供科學(xué)依據(jù)(Huang,2006)。Akhurstetal.(2003)將田間采集的3個(gè)棉鈴蟲種群與室內(nèi)敏感品系交配，在含有Cry1Ac毒素的飼料上篩選16代后檢測(cè)Bt抗性，研究結(jié)果顯示,對(duì)Bt有抗性的棉鈴蟲能夠在表達(dá)Cry1Ac毒素蛋白的轉(zhuǎn)基因棉上完成幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育且羽化繁殖，說(shuō)明棉鈴蟲有可能對(duì)Bt棉產(chǎn)生抗性。Lietal.(2004)通過(guò)F1代篩查法檢測(cè)到2002年采自河北安次縣和山東夏津縣的棉鈴蟲田間種群對(duì)Cry1Ac的抗性基因頻率分別為1×10-3和0.6×10-3左右。陳海燕等(2007)采用改進(jìn)的F1篩查法檢測(cè)到2005年采自河南安陽(yáng)和河北滄縣的棉鈴蟲種群對(duì)CrylAc的抗性基因頻率分別為1.4×10-3和1.5×10-3。劉鳳沂等(2008)采用F1代法在室內(nèi)用喂飼法檢測(cè)了2006年采自河北省邱縣Bt棉田棉鈴蟲對(duì)Bt棉的抗性等位基因頻率，發(fā)現(xiàn)127頭田間雄蟲中24頭攜帶抗性基因，估測(cè)抗性等位基因頻率為0.94，該值為我國(guó)首次檢測(cè)到的高抗性等位基因頻率。須志平(2008)采用單雌系F2代法監(jiān)測(cè)到河北邱縣地區(qū)2003～2005年棉鈴蟲種群對(duì)轉(zhuǎn)基因Bt棉的抗性等位基因頻率為0.0146，該頻率值明顯高于1999 年的監(jiān)測(cè)結(jié)果(何丹軍等，2001)，表明持續(xù)監(jiān)測(cè)棉鈴蟲田間種群的抗性變化十分必要。

本研究表明，鹽城地區(qū)棉鈴蟲種群對(duì)我國(guó)目前的主栽轉(zhuǎn)基因抗蟲棉仍保持很高的敏感性，三龍鎮(zhèn)和東臺(tái)鎮(zhèn)2齡幼蟲對(duì)Bt蛋白的抗性基因頻率分別為7.6×10-3和6.9×10-3。這個(gè)結(jié)果與河北、河南、山東等地的監(jiān)測(cè)結(jié)果(盧美光等，2000)屬于同一數(shù)量級(jí)水平，表明我國(guó)種植轉(zhuǎn)基因棉花地區(qū)的田間棉鈴蟲種群還未出現(xiàn)明顯的抗性進(jìn)化。但是，管理措施不足已經(jīng)導(dǎo)致某些靶標(biāo)害蟲對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲作物抗性的快速發(fā)展(van Rensburg,2007)，且根據(jù)近年來(lái)冀、魯、豫棉區(qū)抗蟲棉抗性監(jiān)測(cè)結(jié)果，抗蟲棉對(duì)棉鈴蟲的防效有下降的趨勢(shì)(呂麗敏等，2013)。這說(shuō)明棉鈴蟲抗性風(fēng)險(xiǎn)依然存在，對(duì)此絕不能放松警惕，必須連續(xù)、系統(tǒng)地做好棉鈴蟲抗性監(jiān)測(cè)工作。

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