章 玲, 李 軍, 麥愛(ài)歡, 梁新劍

(廣東省深圳市人民醫(yī)院 心內(nèi)科, 廣東 深圳, 518000)

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)是由Bloom和Benett等[1]最先在活化的T淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種可溶性的細(xì)胞因子，該因子在體外能抑制巨噬細(xì)胞的自由移動(dòng)，并能引起巨噬細(xì)胞在Ⅳ型超敏反應(yīng)中的聚集。MIF與膠原蛋白的關(guān)系密切，研究[2]發(fā)現(xiàn)MIF可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)，能夠促進(jìn)平滑肌細(xì)胞合成Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)致膠原增生傳導(dǎo)通路已經(jīng)基本明確，本研究探討MIF致膠原增生信號(hào)傳導(dǎo)通路與AngⅡ致膠原增生傳導(dǎo)通路的差異，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SD大鼠4只，雌雄不限(中山醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供)。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液；小牛血清；分析純AngⅡ、MIF(Sigma公司產(chǎn)品)；兔抗鼠MIF抗體；總ERK、ERK抗體; PD 98059。PTC-200PCR儀; MSE微量離心機(jī)；凝膠成像系統(tǒng)；超凈工作臺(tái)；水平搖床；紫外分光光度計(jì); CS臺(tái)式低溫離心機(jī)；臺(tái)式低溫離心機(jī)；生化培養(yǎng)箱。細(xì)胞培養(yǎng)用設(shè)備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將原代大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分為5組，每組6個(gè)樣本，以傳代細(xì)胞培養(yǎng)法調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。接種于六孔板中，先采用無(wú)血清DMEM液饑餓培養(yǎng)24 h后，換用含藥物的10%小牛血清的DMEM液繼續(xù)培養(yǎng)。各組加入藥物具體如下: ① 第1組僅加入含10%小牛血清的DMEM液繼續(xù)培養(yǎng)5、10、20、40、60 min, 作對(duì)照組; ② 第2組加入終濃度為100 ng/mL的MIF繼續(xù)培養(yǎng)5、10、20、40、60 min, 作為MIF刺激組; ③ 第3組加入終濃度為10～6 mol/L的AngⅡ繼續(xù)培養(yǎng)5、10、20、40、60 min, 作為AngⅡ刺激組; ④ 第4組加入終濃度為100 ng/mL的MIF和50 μmol/L的PD 98059繼續(xù)培養(yǎng)5、10、20、40、60 min, 作為MIF+PD 98059作用組(PD 98059先加入1 h后再加MIF); ⑤ 第5組加入終濃度為10～6 mol/L的AngⅡ和50 μmol/L的PD 98059繼續(xù)培養(yǎng)5、10、20、40、60 min, 作為AngⅡ+PD 98059作用組(PD 98059先加入1 h后再加AngⅡ)。收集蛋白質(zhì)并采用Western-blotting法測(cè)定磷酸化ERK、總ERK。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

line 1: MIF作用后平滑肌細(xì)胞ρ-ERK表達(dá); line 2: AngⅡ作用后平滑肌細(xì)胞ρ-ERK表達(dá); line 3: MIF+PD98059作用后平滑肌細(xì)胞ρ-ERK表達(dá); line 4: AngⅡ+PD98059作用后平滑肌細(xì)胞ρ-ERK表達(dá); line 5: 對(duì)照組作用后平滑肌細(xì)胞ρ-ERK表達(dá); line 6: 對(duì)照組作用后平滑肌細(xì)胞總ERK表達(dá)。

MIF、AngⅡ、MIF+ PD 98059、AngⅡ+ PD 98059刺激平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)，測(cè)定磷酸化ERK、總ERK蛋白表達(dá)。Western blotting表明，在44KDa處有明顯的陽(yáng)性條帶，可以確定有磷酸化ERK、總ERK蛋白表達(dá)。見(jiàn)圖1。

以Molecular Analyst軟件進(jìn)行磷酸化ERK灰度值與總ERK蛋白灰度值比較半定量分析，二者的比值代表磷酸化ERK相對(duì)含量，測(cè)定結(jié)果表明，MIF、AngⅡ刺激平滑肌細(xì)胞, 5 min時(shí)AngⅡ刺激組平滑肌細(xì)胞磷酸化ERK相對(duì)含量升高，與對(duì)照組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 40 min時(shí)磷酸化ERK相對(duì)含量達(dá)到最高值, 60 min時(shí)有所下降。而MIF刺激組20 min時(shí)磷酸化ERK升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 60 min時(shí)仍保持較高水平。加用PD 98059后，與各時(shí)點(diǎn)未加PD 98059的MIF、AngⅡ組比較，平滑肌細(xì)胞ERK磷酸化水平均下降(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同藥物刺激平滑肌細(xì)胞各時(shí)點(diǎn)磷酸化ERK相對(duì)含量

3 討 論

MIF是一種多功能細(xì)胞因子,與膠原蛋白的關(guān)系十分密切。膠原在動(dòng)脈硬化的形成中起到重要的作用，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中存在MIF的過(guò)度表達(dá)[3-4]。通過(guò)MIF中和抗體和反義核酸技術(shù)阻斷MIF的表達(dá)則可以使斑塊趨于穩(wěn)定[5]。前期研究表明MIF蛋白可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)增多，可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞合成膠原蛋白，但MIF促進(jìn)膠原合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑卻少有研究報(bào)道。

膠原增生有其經(jīng)典的傳導(dǎo)通路[6]: AngⅡ+AT1R→MAPK/ERK活性增加→C-fos增加→AP1增加→TGF-β增加→膠原增生。MAPK/ERK是其中關(guān)鍵環(huán)節(jié)，ERK是所有MAPKs家族成員中最早被認(rèn)識(shí)，而且是最具特征性的[7]。ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的大致模式為：多種生長(zhǎng)因子→Ras→Raf→MEK1/2ERK→有絲分裂、分化[8-9]。應(yīng)用絲裂原激活蛋白激酶/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MAPK/ERK)通路高效選擇性抑制劑(PD 98059)能阻止AngⅡ促前膠原合成作用, PD 98059如果能夠阻止MIF促進(jìn)膠原合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，則可以推測(cè)MIF促進(jìn)膠原合成也經(jīng)過(guò)MAPK/ERK這個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Leng等[10]研究發(fā)現(xiàn),MIF可能通過(guò)與細(xì)胞膜表面蛋白CD74的細(xì)胞外基團(tuán)結(jié)合而發(fā)揮作用,激活胞內(nèi)的絲裂原激活蛋白激酶家族的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,從而引起各種細(xì)胞的增生及炎性介質(zhì)的合成與釋放,產(chǎn)生各種生理效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論AngⅡ還是MIF均可以使磷酸化ERK增多，使用PD 98059可以看到AngⅡ和MIF引起平滑肌細(xì)胞磷酸化ERK水平增高的作用被明顯抑制，說(shuō)明AngⅡ和MIF均可以激活MAPK/ERK途徑，提示MIF對(duì)平滑肌細(xì)胞膠原的合成作用可能與AngⅡ致膠原增生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵環(huán)節(jié)是一樣的。實(shí)驗(yàn)中還觀察到, AngⅡ作用于平滑肌細(xì)胞, 5 min即可出現(xiàn)磷酸化ERK水平增高, 40 min達(dá)到高峰, 60 min后磷酸化ERK水平開(kāi)始下降，這與以前的文獻(xiàn)報(bào)道[7]相似，而MIF作用于平滑肌細(xì)胞, 20 min后才見(jiàn)到細(xì)胞磷酸化ERK升高，60 min仍在較高水平, MIF組致細(xì)胞磷酸化ERK出現(xiàn)的時(shí)間和峰值較AngⅡ作用于平滑肌細(xì)胞后出現(xiàn)的時(shí)間和峰值晚。Lue等[11]研究發(fā)現(xiàn), MIF可通過(guò)瞬時(shí)(30 min以內(nèi))和持續(xù)(24 min以上)磷酸化激活ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑兩種方式而發(fā)揮重要生物學(xué)作用。Kleemann等[12]利用熒光受體和凝膠電泳分析證實(shí)內(nèi)源性和外源性MIF能夠抑制Jab1誘導(dǎo)的AP1轉(zhuǎn)錄活性,表明MIF可以通過(guò)Jab1-AP1途徑發(fā)揮生物學(xué)作用。MIF促進(jìn)膠原合成不排除還有其他途徑可能，需要進(jìn)一步的研究。

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