陳彪 屈鵬飛 賈志宇 李曉玲 楊威 張英懷

·論著·

吳茱萸堿抑制涎腺腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞侵襲的實(shí)驗(yàn)研究

陳彪 屈鵬飛 賈志宇 李曉玲 楊威 張英懷

目的研究吳茱萸堿對(duì)涎腺腺樣囊性癌 ACC-M 細(xì)胞侵襲的影響。方法用終濃度為0、 0.01、 0.1、 1、 10、 100 μg/ml的吳茱萸堿處理 ACC-M細(xì)胞2、4、6、8、10 h后，應(yīng)用transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)和觀察ACC-M細(xì)胞的侵襲抑制情況。結(jié)果吳茱萸堿處理組較對(duì)照組穿過(guò)上室底面膜的細(xì)胞數(shù)少，細(xì)胞數(shù)隨濃度增大，時(shí)間增長(zhǎng)基本呈遞減趨勢(shì)，侵襲抑制率隨濃度的增大而增大，隨時(shí)間的增長(zhǎng)而增大，侵襲抑制率最高可達(dá)59.99%。結(jié)論吳茱萸堿可以抑制涎腺腺樣囊性癌 ACC-M細(xì)胞侵襲。

吳茱萸堿；涎腺腺樣囊性癌；侵襲

涎腺腺樣囊性癌是最常見的惡性腫瘤之一，浸潤(rùn)性極強(qiáng)和易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是腺樣囊性癌的重要特征，因此術(shù)后復(fù)發(fā)率高，生存率也比較低[1]。目前具有抗腫瘤活性的植物有效成分受到了極大關(guān)注[2]，吳茱萸堿(evodiamine)就是其中之一,研究表明，吳茱萸堿可以誘導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖[3]。但是，吳茱萸堿是否能抑制涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞的侵襲，國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料 人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系 ACC-M 由上海交通大學(xué)口腔頜面外科實(shí)驗(yàn)室提供。采用 RPMI 1640 培養(yǎng)基加入10% 胎牛血清和抗生素，于37℃、5% CO2恒溫箱內(nèi)飽和濕度培養(yǎng)，24～48 h傳1 代，以0．04%二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)和0.25%胰蛋白酶混合液消化傳代。吳茱萸堿購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度≥98%。用二甲基亞砜配制成100 mg/ml的儲(chǔ)存液，儲(chǔ)存于-20℃冰箱中。使用前用培養(yǎng)液稀釋，培養(yǎng)液中加入等量二甲基亞砜作為對(duì)照組。Matrigel基質(zhì)膠，購(gòu)自美國(guó)BD公司(貨號(hào)356234)。Transwell小室，購(gòu)自美國(guó)康寧公司(貨號(hào)3422)。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，PROSPEC產(chǎn)品(貨號(hào)CYT-244)。

1.2 方法

1.2.1 transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)：每一個(gè)transwell小室上室膜的底面預(yù)先鋪好Matrigel基質(zhì)膠 50 μl(將50 μl的微量加樣器末端剪去后逐個(gè)加入)；下室內(nèi)加入含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)(化學(xué)趨化物)的細(xì)胞培養(yǎng)液200 μl(30 μg/200 ml)；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(即是細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的時(shí)期)的細(xì)胞，用10%的細(xì)胞培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液20 ml，其內(nèi)共有細(xì)胞數(shù)為1.8×107個(gè)。在每個(gè)transwell小室的上室分別加入含有 2×105個(gè)分別用0 μg/ml(空白對(duì)照)，0.01 μg/ml，0.1 μg/ml，1 μg/ml，10 μg/ml，100 μg/ml的吳茱萸堿處理(37℃，20 min)的ACC-M細(xì)胞混勻液200 μl，37℃，5%CO2的條件下孵育；共5組，每組3個(gè)副孔；反應(yīng)2、4、6、8、10 h后，在相應(yīng)的時(shí)間，將相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組小室上室面微孔膜上的細(xì)胞用棉簽擦去(注意保護(hù)下室面膜上細(xì)胞不受影響)，10%甲醛溶液固定30 min后行Wright-Giemsa染色。

1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)：將小室由培養(yǎng)板中取出，將上室底部的整個(gè)膜以“井”字劃分為9格，在400×鏡下觀察，在中心格隨機(jī)選一個(gè)視野，膜周邊格隨機(jī)選四個(gè)格，各選一個(gè)視野，計(jì)數(shù)5個(gè)視野穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞總數(shù)。每組4個(gè)樣本。侵襲抑制率公式如下：(對(duì)照小室穿膜細(xì)胞數(shù)均值-處理小室穿膜細(xì)胞數(shù)均值)/對(duì)照小室穿膜細(xì)胞數(shù)均值×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，使用Mauchly的球形度檢驗(yàn)(P=0.141>0.01)，得出數(shù)據(jù)滿足協(xié)方差矩陣球?qū)ΨQ的條件，不需對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正。而后進(jìn)行主體內(nèi)效應(yīng)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)時(shí)間組合濃度組之間是否存在交互作用；使用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)分別檢驗(yàn)5個(gè)時(shí)間組間和5個(gè)濃度組間以及時(shí)間組和濃度組之間是否存在差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Matrigel基質(zhì)膠，模擬體外侵襲模型中的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的作用，觀察吳茱萸堿對(duì)人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞系侵襲能力的影響。與對(duì)照組比較，各處理組的穿膜細(xì)胞數(shù)隨著藥物濃度的增加而減少，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而減少；根據(jù)穿膜細(xì)胞數(shù)計(jì)算出侵襲抑制率，侵襲抑制率呈現(xiàn)隨著藥物濃度的增高，時(shí)間的增長(zhǎng)而增大的趨勢(shì)；在10 h，100 μg/ml時(shí)侵襲抑制率可達(dá)59.99%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同藥物濃度組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.245，P<0.05)，即穿膜數(shù)細(xì)胞和藥物濃度之間為依賴關(guān)系，隨著藥物濃度的增加，穿膜細(xì)胞數(shù)減少，侵襲抑制率增大；但不同時(shí)間組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.050，P>0.05),即時(shí)間組和侵襲抑制率之間無(wú)依賴關(guān)系可循；時(shí)間組與濃度組之間不存在交互作用(F=1.426，P>0.05)。見表1、圖1。

表1 各吳茱萸堿處理組穿膜細(xì)胞數(shù)

表1 各吳茱萸堿處理組穿膜細(xì)胞數(shù)

組別2h4h6h8h10h0μg/ml組217.7±8.0224.3±6.1225.3±9.4226.7±10.0231.7±15.60.01μg/ml組171.7±4.5162.3±6.5159.0±4.0153.7±3.1148.3±4.50.1μg/ml組160.3±3.1158.0±6.6153.3±3.5150.0±6.0140.0±13.01μg/ml組155.3±11.9147.0±5.3144.0±5.0140.7±9.1134.0±11.510μg/ml組139.3±1.5134.7±5.8130.3±9.0129.7±9.4114.7±3.2100μg/ml組126.7±7.0123.7±6.1115.3±6.0106.3±17.692.7±5.7

圖1 不同時(shí)間組和濃度組的侵襲抑制率

3 討論

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為吳茱萸有溫中散寒，疏肝止痛之功效，常用于脘腹冷痛，嘔吐腹瀉，頭痛胃痛和痛經(jīng)等。近代醫(yī)學(xué)證明吳茱萸有鎮(zhèn)痛，安神，抗菌，降壓等藥理作用[4]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于吳茱萸堿抗腫瘤作用的研究較少。Ogasawara等[5-7]研究了吳茱萸堿對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞26-L5，Lewis肺癌細(xì)胞LLC和惡性黑色素瘤細(xì)胞 B16-F10的作用，發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿可通過(guò)濃度依賴方式抑制結(jié)腸癌細(xì)胞26-L5的侵襲，在10 mg/ml濃度時(shí)可達(dá)到70%的抑制。用10 mg/ml濃度吳茱萸堿處理過(guò)的LLC 和26-L5腫瘤細(xì)胞接種于裸鼠體內(nèi)后，可顯著降低肺轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移。其中吳茱萸堿處理過(guò)的26-L5細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移減少了70%。接種26-L5細(xì)胞后第6天開始應(yīng)用吳茱萸堿的裸鼠，與對(duì)照組相比，肺內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)目減少48%。吳茱萸堿以濃度依賴方式抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，在30 mmol/L濃度時(shí)對(duì)3種細(xì)胞系均達(dá)到完全抑制[5-7]。近來(lái)研究表明吳茱萸堿對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌Tca-8113 細(xì)胞有明顯的放射增敏作用，并能改變 Tca-8113 細(xì)胞的黏附和遷移能力[8]。這些結(jié)果表明，吳茱萸堿可用于抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的治療。

本研究用 Matrigel基質(zhì)膠觀察細(xì)胞侵襲力，在體外模擬腫瘤細(xì)胞侵襲的過(guò)程。結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)不同濃度的吳茱萸堿處理過(guò)的 ACC-M 細(xì)胞與對(duì)照組相比，其細(xì)胞的侵襲穿膜率受到抑制，侵襲抑制率隨著藥物濃度的增加和時(shí)間的增長(zhǎng)而增大；在10 h，100 μg/ml時(shí)侵襲抑制率可達(dá)59.99%；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同的濃度組之間存在差別(P<0.01)，吳茱萸堿對(duì)人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞系侵襲力的影響和其本身的藥物濃度呈依賴關(guān)系，在一定的藥物濃度范圍內(nèi)，濃度越高抑制作用越明顯；而時(shí)間對(duì)于細(xì)胞抑制率的影響經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析不存在差別(P>0.01)，也就是說(shuō)本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間組得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能說(shuō)明吳茱萸堿對(duì)與人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞系侵襲的抑制作用呈時(shí)間依賴性；這可能一方面與本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間組之間間隔短有關(guān)系，另一方面與實(shí)驗(yàn)體系及不同腫瘤細(xì)胞系本身的特異性有關(guān)系。另外時(shí)間組和濃度組對(duì)于人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞系侵襲的抑制作用不存在交互性(P<0.01)。

目前，關(guān)于吳茱萸堿抗腫瘤的機(jī)制尚不確切，有文獻(xiàn)報(bào)道，吳茱萸堿通過(guò)抑制NF-kB[9]的活性來(lái)抑制NF-kB激活通路上的關(guān)鍵環(huán)節(jié)阻斷其激活過(guò)程，以達(dá)到阻斷 NF-kB調(diào)控的抗凋亡基因及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的基因轉(zhuǎn)錄。另外通過(guò)原位分析技術(shù)，人們發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿可抑制微管蛋白的多聚化和紡錘體的形成，并且進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿 N-14位上的甲基和 C-13位上的氫與吳茱萸堿的抗腫瘤活性有很大的相關(guān)性[10]。亦可能與下調(diào)PLK1基因表達(dá)有關(guān)[11]。但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

1 楊威，陳彪，張英懷，等．姜黃素對(duì)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系SACC-83增殖和凋亡的影響.現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志，2009，23:142-144．

2 賈志宇，陳彪，郭立華，等．丹參酮ⅡA 對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系 TCA-83 增殖和凋亡的影響．實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2012，28: 59-63．

3 賈志宇,邸永賓,李曉玲,等.吳茱萸堿抑制涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系 ACC-M 增殖的實(shí)驗(yàn)研究．實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2012，28:592-596.

4 劉蘊(yùn)秀,羅淑榮.吳茱萸中生物堿成分的研究新進(jìn)展．天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2000,12:87-94.

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6 Ogasawara M,Matsubara T,Suzuki H.Screening of natural compounds for inhibitory activity on colon cancer cell migration.Biol Pharm Bull,2001,24：720-723.

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11 程兆明,周永靜,張尤歷，等.吳茱萸堿對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖、侵襲和保羅樣激酶-1基因表達(dá)的影響．江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，21:69-72．

ExperimentalstudyoftheeffectofevodiamineontheinvasionofsalivaryadenoidcysticcarcinomaACC-Mcells

CHENBiao,QUPengfei,JIAZhiyu,etal.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China.

ObjectiveTo investigate the effects of evodiamine on the invasive behaviors of salivary adenoid cystic carcinoma ACC-M cells.MethodsACC-M cells were treated with evodiamine at 0,0.01,0.1,1,10,100μg/ml for 2h,4h,6h,8h,10h,respectively,then transwell invasion assay was used to examine the inhibition invasion condition of ACC-M cells.ResultsAs compared with that in control group,the number of the cell though the upper chamber in the evodiamine-treatment group was decreased.The cells' number showed a gradual decreasing trend with concentration increasing and time prolonging.The invasion inhibition rate was increased with the increasing of drug concentration and action time.The highest invasion inhibition rate was 59.99%.There was a significant difference in number of the cell though the upper chamber among different concentration groups (P<0.05).ConclusionEvodiamine is able to inhibit the invasion of ACC-M cells.

evodiamine;salivary adenoid cystic carcinoma;invasion

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.09.003

項(xiàng)目來(lái)源:河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(編號(hào):2005007)；河北省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(編號(hào):2006093)

050000 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔頜面外科[陳彪、屈鵬飛、賈志宇、李曉玲(現(xiàn)工作單位為解放軍306醫(yī)院口腔科)、楊威、張英懷]

R 871.7

A

1002-7386(2014)09-1290-03

2013-11-05)