許新明 王莉 劉明 徐袁秋

·論著·

吡柔比星在骨肉瘤細(xì)胞放射增敏中的作用研究

許新明 王莉 劉明 徐袁秋

目的 研究吡柔比星在骨肉瘤細(xì)胞MG-63的放射增敏中的作用。方法用MTT法檢測不同濃度吡柔比星對對數(shù)生長期的MG-63細(xì)胞的抑制作用，確定IC10的數(shù)值，作為實(shí)驗(yàn)的藥物濃度。用克隆形成分析法測定MG-63細(xì)胞在IC10濃度吡柔比星作用24 h后給予不同劑量(0、2、4、6、8Gy)照射以及IC10濃度紫杉醇作用不同時(shí)間(12、24、36 h)后給予一定劑量射線照射的存活分?jǐn)?shù)(SF)，擬合細(xì)胞生存曲線并計(jì)算放射增敏比，分析吡柔比星作用于MG-63細(xì)胞不同時(shí)間(12、24、36 h)后細(xì)胞生存率的變化。結(jié)果不同濃度吡柔比星作用24 h后，MG-63細(xì)胞抑制率逐漸增高(P<0.01)，其藥物毒性呈濃度依賴性，IC10為0.004 μg/ml。IC10濃度吡柔比星増敏比分別1.49(D0比)、1.06(Dq比)和1.04(SF2比)，MG-63細(xì)胞α/β值為2.23，IC10濃度吡柔比星作用后為0.27。IC10濃度吡柔比星作用于MG-63細(xì)胞不同時(shí)間后再進(jìn)行照射，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)隨時(shí)間延長逐漸降低(P<0.01)。結(jié)論吡柔比星對MG-63細(xì)胞有放射增敏作用，在一定時(shí)間內(nèi)與藥物作用時(shí)間呈正相關(guān)。

吡柔比星；骨肉瘤；放射增敏

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是最常見的原發(fā)骨腫瘤，主要發(fā)病于青少年[1]，5年生存率為70%左右，治療方法主要為手術(shù)和化療[2]。但是有約20%患者骨肉瘤生長在脊柱、骨盆等手術(shù)不易切除的部位[1]。對于這些患者，放射治療顯得尤為必要。吡柔比星是治療腫瘤的一種常見藥物，廣泛用于惡性淋巴瘤、乳腺癌、膀胱癌等多種腫瘤的治療中[3,4]，對骨肉瘤的治療亦有較好的療效[5]。本研究主要目的即觀察吡柔比星對骨肉瘤細(xì)胞的放射增敏效果及其與藥物作用時(shí)間的關(guān)系，以期為臨床應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、藥物和試劑 本研究所用骨肉瘤細(xì)胞株MG-63由河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供，為單層貼壁生長；吡柔比星由浙江海正藥業(yè)公司生產(chǎn)(生產(chǎn)批號：121201)；DMEM和胎牛血清購自HyClone公司；噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)由購自Solarbio公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于含5%CO2、37℃恒溫的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0.25%胰酶消化、傳代，取對數(shù)生長的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 照射條件及方法 采用直線加速器(Varian IX)產(chǎn)生的6 MV X線進(jìn)行照射，劑量率為300 cGy/min，細(xì)胞面覆蓋硅膠與放射源距離為100 cm，室溫下照射。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 MTT實(shí)驗(yàn)：將對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度至3×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每組6個(gè)復(fù)孔，每孔100 μl，培養(yǎng)12～16 h至細(xì)胞貼壁，將吡柔比星按比例稀釋加入96孔板，同時(shí)設(shè)對照組及調(diào)零孔。置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后每孔加入新鮮配制的MTT(5 mg/ml)15 μl，再次孵育4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，震蕩10 min，于酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度(測定波長520 nm)并計(jì)算IC10。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。細(xì)胞抑制率=(1-A加藥/A對照)×100%。

1.4.2 克隆形成分析實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞常規(guī)消化后分別按不同照射劑量以不同密度接種于6孔板，培養(yǎng)12～16 h至貼壁，按分組要求加入藥物、進(jìn)行照射，照射完成后于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～14 d，取出培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，無水乙醇固定15 min，去除固定液，結(jié)晶紫色30 min，對含50個(gè)細(xì)胞以上的克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算克隆形成率及細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)?？寺⌒纬陕?PE)=克隆數(shù)/接種的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)(SF)=處理細(xì)胞克隆形成率(PE處)/對照細(xì)胞克隆形成率(PE對)。

1.5 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及分組

1.5.1 細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)：采用MTT法進(jìn)行檢測不同濃度藥物對MG-63細(xì)胞的生長抑制作用。按藥物濃度不同分為7組，分別為：0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10和100 μg/ml，同時(shí)設(shè)對照組。

1.5.2 采用克隆形成分析法測定藥物放射增敏性：根據(jù)前期MTT法測的結(jié)果，以IC10(0.004 μg/ml)作為吡柔比星實(shí)驗(yàn)濃度，實(shí)驗(yàn)分為單純照射組(照射劑量分別為0、2、4、6和8 Gy)和藥物作用24 h后照射組(照射劑量同單純照射組)。

1.5.3 采用克隆形成分析法測定最佳照射時(shí)間：將接種好的細(xì)胞分為對照組、吡柔比星12 h+照射組、吡柔比星24 h+照射組、吡柔比星36 h+照射組，吡柔比星濃度為0.004 μg/ml，照射劑量為4 Gy。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 多組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；細(xì)胞存活曲線采用多靶單擊數(shù)學(xué)模型SF=1-(1-e(-D/D0))N進(jìn)行擬合，Dq=D0·lnN，求出平均致死劑量(D0)、準(zhǔn)閾劑量(Dq)和照射劑量為2Gy的存活分?jǐn)?shù)(SF2)，根據(jù)曲線參數(shù)計(jì)算增敏比(SER)，SER分別用D0比、Dq比和SF2比表示(D0比=單照射D0/處理D0，Dq比=單照射Dq/處理Dq，SF2比=單照射SF2/處理SF2)；采用SPSS 13.0及Origin Pro 8.5軟件，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測不同濃度吡柔比星對MG-63細(xì)胞的生長抑制作用 采用不同濃度吡柔比星作用24 h后MG-63細(xì)胞存活情況可見，隨著吡柔比星濃度的增高，細(xì)胞生長抑制率增加(F=202.60，P<0.01)，當(dāng)藥物濃度達(dá)到100 μg/ml時(shí)，其增殖抑制率達(dá)到88.49%，顯示出較強(qiáng)的增殖抑制作用。其藥物毒性呈濃度依賴性，IC10為0.004 μg/ml。見表1、圖1。

濃度(μg/ml)吸光度細(xì)胞抑制率(%)對照組0．60±0．09—0．00010．57±0．116．5±3．90．0010．56±0．117．0±6．30．010．56±0．116．7±5．40．10．44±0．0926．0±6．410．32±0．0747．2±3．3100．09±0．0184．7±0．51000．07±0．0288．5±1．3

圖1 不同濃度吡柔比星對MG-63細(xì)胞的生長抑制作用

2.2 吡柔比星對MG-63細(xì)胞的放射增敏作用 IC10濃度吡柔比星作用于MG-63細(xì)胞24 h后聯(lián)合不同劑量X線照射，細(xì)胞存活曲線圖可見，通過分析多靶單擊模型表明：單純照射D0、Dq和SF2值分別為2.51Gy、2.42Gy、0.79，吡柔比星作用24 h后照射D0、Dq和SF2值分別為1.69Gy、2.29Gy、0.76，増敏比為1.49(D0比)、1.06(Dq比)、1.04(SF2比)，表明吡柔比星對MG-63細(xì)胞有一定的增敏作用，且高劑量照射增敏效果佳。線性二次模型的結(jié)果顯示：骨肉瘤的α、β和α/β值分別為0.067、0.030和2.23，吡柔比星作用后α、β和α/β值分別為0.017、 0.064和0.27。α/β值較吡柔比星作用前減小。見圖2、3。

圖2 吡柔比星對MG-63細(xì)胞放射敏感性的影響(多靶單擊模型)

圖3 吡柔比星對MG-63細(xì)胞放射敏感性的影響(線性二次模型)

2.3 吡柔比星作用后最佳照射時(shí)間 吡柔比星加照射組與單純照射組比較，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且吡柔比星作用不同時(shí)間后照射組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，吡柔比星對MG-63細(xì)胞作用36 h后照射細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)最低，表明吡柔比星對MG-63細(xì)胞的放射增敏效果與藥物作用時(shí)間呈正相關(guān)性(r=0.962，P<0.05)。見表2。

組別存活分?jǐn)?shù)單純照射12．86±1．07吡柔比星12h+照射組5．67±0．44?吡柔比星24h+照射組3．37±0．31?#吡柔比星36h+照射組0．52±0．08?#△

注：與單純照射組比較，*P<0.05；與吡柔比較12 h+照射組比較，#P<0.05；與吡柔比星24 h+照射組比較，△P<0.05

3 討論

多年來隨著多種化療藥物相繼應(yīng)用于骨肉瘤的治療，骨肉瘤的生存率逐漸提高達(dá)到70%左右[6]。目前治療骨肉瘤的化療方案以阿霉素、順鉑、大劑量甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺等多藥聯(lián)合化療為主。但是大劑量聯(lián)合化療帶來的不良反應(yīng)也受到人們的重視，Bacci等[7]對無轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者進(jìn)行長期隨訪發(fā)現(xiàn)阿霉素造成的心臟毒性和男性不育是化療的兩個(gè)主要并發(fā)癥。相對于阿霉素而言，吡柔比星的心臟毒性則明顯較輕。吡柔比星是1979年由日本微生物化學(xué)研究所梅澤濱夫(H.Umezawa)等研制開發(fā)的新一代蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤抗生素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與多柔比星相近，是多柔比星氨基糖部分第4’位OH基上的一個(gè)異構(gòu)體。對癌細(xì)胞的作用機(jī)制主要是進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，迅速分布于細(xì)胞核，抑制DNA聚合酶α和β，阻礙核酸的合成。藥物嵌入DNA的雙螺旋鏈，使腫瘤細(xì)胞終止在G2期，不能進(jìn)行到細(xì)胞分裂期，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。Shinozaki等[8]研究表明以吡柔比星為基礎(chǔ)的化療方案比以阿霉素為基礎(chǔ)的化療方案更具優(yōu)勢，對于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的骨肉瘤吡柔比星也有較好的療效[9,10]，故吡柔比星常用于骨肉瘤的化療。

放射治療是治療惡性腫瘤的另一有效手段，一般認(rèn)為骨肉瘤對于放療不敏感，但是對于某些特殊部位不能手術(shù)或手術(shù)無法徹底切除或切緣陽性及誘導(dǎo)化療組織學(xué)反應(yīng)不佳的患者，放射治療則不可缺少。術(shù)前放療可提高截肢術(shù)的成功率，減少腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。Anacak等[11]把手術(shù)植骨與體外放療相結(jié)合，在22個(gè)月的隨訪期內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和手術(shù)失敗，取得了很好的療效。

隨著多種放射增敏藥物的發(fā)現(xiàn)，多種對放射線不敏感的腫瘤得以獲得更好的治療，目前對吡柔比星在骨肉瘤放射治療中的作用研究報(bào)道較少。本研究在吡柔比星作用于骨肉瘤細(xì)胞24 h后對瘤細(xì)胞進(jìn)行不同劑量照射，發(fā)現(xiàn)増敏比均>1，表明吡柔比星對骨肉瘤細(xì)胞亦有較好的放射增敏作用。分析原因可能為：(1)吡柔比星聯(lián)合放射使MG-63細(xì)胞存活曲線肩區(qū)變窄，Dq值變小，在多靶單擊模型中Dq變小意味著亞致死損傷修復(fù)減少。(2)吡柔比星可將細(xì)胞阻滯于G2期，而在細(xì)胞周期中由于處于G2/M期的細(xì)胞對放射線最敏感，從而促進(jìn)瘤細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出放射增敏作用。本研究同時(shí)顯示吡柔比星作用于MG-63細(xì)胞不同時(shí)間后，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)逐漸減小，表明吡柔比星的放射增敏作用與作用于腫瘤細(xì)胞的時(shí)間有關(guān)，其機(jī)制可能為吡柔比星對細(xì)胞周期(主要是G2/M期)阻滯的積累作用增加了腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。任振泰等[12]研究多西紫杉醇對A549細(xì)胞的放射增敏作用發(fā)現(xiàn)藥物作用24 h后進(jìn)行X線照射細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)最低，其后時(shí)間延長細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)則增高。本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行更多分組，吡柔比星作用延長更多時(shí)間后細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)是否會更小有待進(jìn)一步研究。研究結(jié)果提示，在臨床中實(shí)施骨肉瘤的治療方案時(shí)，吡柔比星與放療序貫結(jié)合可能會使藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)提高放其放射敏感性，進(jìn)而獲得更好的療效。另外研究表明單次大劑量(>2 Gy)的照射較單次劑量2 Gy的常規(guī)照射增敏效果更好，提示臨床中可采用大分割放療。另外，本研究發(fā)現(xiàn)藥物作用后線性二次模型α/β值變化較大，提示在同步放化療時(shí)吡柔比星化療方案結(jié)束后需注意及時(shí)調(diào)整放療劑量及方案，以達(dá)到準(zhǔn)確的生物有效劑量。

1 Sakamoto A,Iwamoto Y.Current status and perspectives regarding the treatment of osteo-sarcoma:chemotherapy.Rev Recent Clin Trials,2008,3:228-231.

2 Longhi A,Errani C,De Paolis M,et al.Primary bone osteosarcoma in the pediatric age:state of the art.Cancer Treat Rev,2006,32:423-436.

3 Li Y,Tang JH,Huang XE,et al.Clinical comparison on the safety and efficacy of fluorouracil/pirarubicin/cyclophosphamide (FPC) with fluorouracil/epirubicin/cyclophosphamide (FEC) as postoperative adjuvant chemotherapy in breast cancer.Asian Pac J Cancer Prev,2011,12:1795-1798.

4 黃慧強(qiáng),彭玉龍,蔡清清,等.含吡柔比星聯(lián)合化療方案治療392例非霍奇金淋巴瘤患者長期隨訪結(jié)果分析.中華血液學(xué)雜志,2005,26:577-580.

5 趙暉,楊晨,王智煜,等.含吡柔比星方案治療骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者的療效及心臟功能評估.腫瘤,2010,30:860-864.

6 Bielack SS,Kempf-Bielack B,Heise U,et al.Combined modality treatment for osteosarcoma occurring as a second malignant disease.Cooperative German-Austrian-Swiss Osteosarcoma Study Group.J Clin Oncol,1999,17:1164.

7 Bacci G,Ferrari S,Bertoni F,et al.Long-term outcome for patients with nonmetastatic osteosarcoma of the extremity treated at the istituto ortopedico rizzoli according to the istituto ortopedico rizzoli/osteosarcoma-2 protocol:an updated report.J Clin Oncol,2000,18:4016-4027.

8 Shinozaki T,Watanabe H,Yanagawa T,et al.Pirarubicin-based versus doxorubicin-based osteosarcoma chemotherapy.Ann Pharmacother,2002,36:996-999.

9 He A,Qi W,Huang Y,et al.Comparison of pirarubicin-based versus gemcitabine-docetaxel chemotherapy for relapsed and refractory osteosarcoma:a single institution experience.Int J Clin Oncol,2013,18:498-505.

10 Zhao H,Yao Y,Wang Z,et al.Therapeutic effect of pirarubicin-based chemotherapy for osteosarcoma patients with lung metastasis.J Chemother,2010,22:119-124.

11 Anacak Y,Sabah D,Demirci S,et al.Intraoperative extracorporeal irradiation and re-implantation of involved bone for the treatment of musculoskeletal tumors.J Exp Clin Cancer Res,2007,26:571-574.

12 任振泰,崔靜,李甸源,等.多西紫杉醇對A549細(xì)胞的放射增敏作用.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2011,46:315-317.

·消 息·

雜志稿件內(nèi)容的有關(guān)規(guī)范要求

1.當(dāng)報(bào)告以人為研究對象的試驗(yàn)時(shí)，作者應(yīng)該說明其遵循的程度是否符合負(fù)責(zé)人體試驗(yàn)的委員會(單位性的、地區(qū)性的或國家性的)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到該委員會的批準(zhǔn)，是否取得受試對象的知情同意。

2.根據(jù)GB/T 7408-94《數(shù)據(jù)元和交換格式 信息交換 日期和時(shí)間表示法》，由特定起點(diǎn)與終點(diǎn)定界的時(shí)間段的表示，起點(diǎn)與終點(diǎn)之間以一字線為分隔符，而不再用波紋線。示例如下：2001—2004年，而不再表示為2001～2004年，但“—”也可以用“至”取代。注意：除了上述時(shí)間段之外的其他計(jì)數(shù)、計(jì)量范圍的表示，仍然用“～”，如2～8 kg。

3.根據(jù)人民衛(wèi)生出版社出版的全國高等學(xué)校教材《衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)》第5版，報(bào)告統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的結(jié)論時(shí)，對P值小于或等于檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(一般為0.05)的情況，一律描述為“差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義”，同時(shí)寫明P值的具體數(shù)值或相應(yīng)的不等式，不再采用將P<0.05描述為“差異有顯著意義(或差異有顯著性)”、將P<0.01描述為“差異有非常顯著意義(或差異有非常顯著性)”的表達(dá)方法。在用不等式表示P值的情況下，一般選用P>0.05、P<0.05和P<0.01三種表達(dá)方式即可滿足需要，無須再細(xì)分為P<0.001或P<0.0001。

4.為便于表格的排版和版式的美觀，表格中注釋用的角碼符號一律采用單個(gè)角碼的形式，按下列順序選用：*、#、△、☆、▲、★；在表注中依先縱后橫的順序依次標(biāo)出。

本刊編輯部

Studyontheeffectofpirarubicininradiosensitizationofosteosarcomacellsinvitro

XUXinming,WANGLi,LIUMing,etal.DepartmentofRadiotherapy,TheThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China

ObjectiveTo investigate the effect of pirarubicin in radiosensitization of human osteosarcoma cells (MG-63) in vitro.MethodsMTT was used to measure the inhibitory effect of pirarubicin on MG-63cells at exponential growth phase to determine IC10 as drug concentration of experiment.After MG-63 were treated with IC10 concentration pirarubicin for 24 hours,the cells were given different doses (0,2,4,6,8Gy) of irradiation as well as IC10 concentration paclitaxel for different time points (12h,24h,36h),finally the cell survival fraction (SF) was detected by clone formation analysis method,radiosensitization ratio was calculated by fitting cell survival curve,and the changes of cell survival rate of MG-63 treated by pirarubicin in different time points (12h,24h,36 h) were analyzed.ResultsAfter 24-hour pirarubicin administration,the cell inhibition rate was gradually increased (P<0.01),and the drug toxicity was dose-dependent,with IC10 concentration being 0.004μg/ml.According to D0,Dq and SF2 value,the sensitivity enhancement ratio (SER) of IC10 concentration pirarubicin was 1.49,1.06 and 1.04,respectively,theα/β ratio of MG-63 cells was 2.23,after treated with IC10 concentration pirarubicin,which was 0.27.After treated with IC10 concentration pirarubicin,MG-63 cells

irradiation.The cell survival fraction was gradually decreased with the time prolongation (P<0.01).ConclusionPirarubicin has radiosensitizing effect on MG-63 cells,and the effect is positively correlated to effect time of drug within a certain time.

pirarubicin；osteosarcoma；radiosensitization

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.02.004

項(xiàng)目來源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)重點(diǎn)研究課題(編號：20120095)

050051 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院放療科

徐袁秋，050051 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院放射科；

E-mail：yuanqiuxqian@hotmail.com

R 730.55

A

1002-7386(2014)02-0173-04

2013-07-23)