薛晨晨，何方軍，趙建立，尹燕華，白祥軍，李占飛

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，創(chuàng)傷發(fā)生率呈增高趨勢(shì)，已成為當(dāng)前國(guó)人重要死亡原因。嚴(yán)重創(chuàng)傷患者常出現(xiàn)免疫功能障礙，主要表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞功能抑制，是創(chuàng)傷患者發(fā)生繼發(fā)感染和膿毒癥，進(jìn)而導(dǎo)致患者死亡的重要原因[1]。近年來(lái)我國(guó)人口老齡化趨勢(shì)明顯，老年人口比例顯著增加。老年人免疫系統(tǒng)功能較年輕人明顯衰退和減弱，在創(chuàng)傷時(shí)更易發(fā)生繼發(fā)感染和死亡。但對(duì)老年患者免疫功能衰退的分子與細(xì)胞機(jī)制，目前尚知之甚少。

髓源抑制細(xì)胞(myeloid derived suppressor cells，MDSCs)是重要的調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞，包括未成熟粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和髓系祖細(xì)胞等，對(duì)T淋巴細(xì)胞功能具有強(qiáng)大的抑制作用[2]。近年研究提示MDSCs的擴(kuò)增和活化在腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病中起重要作用[3-4]，它也是膿毒癥和創(chuàng)傷時(shí)免疫抑制的重要機(jī)制[5-7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，老年小鼠中MDSCs數(shù)量和抑制活性均較青年小鼠顯著增高，提示MDSCs擴(kuò)增和活化與衰老導(dǎo)致的免疫抑制密切相關(guān)[8-11]。但MDSCs在不同年齡組創(chuàng)傷患者中有無(wú)差異，國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。因此，本研究比較青年和老年創(chuàng)傷患者外周血MDSCs數(shù)量，以增加對(duì)老年創(chuàng)傷患者免疫抑制發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

材料與方法

1 臨床資料與分組

研究組： 收集2013年5月～2013年9月于我科收治的嚴(yán)重多發(fā)傷患者，隨機(jī)選取其中18～30歲患者26例和>60歲患者21例。入選標(biāo)準(zhǔn)： (1) 創(chuàng)傷嚴(yán)重程度評(píng)分(injury severity score,ISS)≥16分； (2) 本次受傷前1月內(nèi)無(wú)感染性疾病史； (3) 自起病至來(lái)我科就診時(shí)間<24h。青年組和老年組ISS評(píng)分無(wú)顯著差異。青年對(duì)照組： 9例本院健康醫(yī)務(wù)人員，年齡23～30歲，均于1月內(nèi)無(wú)感染病史。老年對(duì)照組： 5例健康人，年齡60～65歲，均于1月內(nèi)無(wú)感染疾病史。

2 主要試劑

人CD11b-FITC抗體、CD14-PE抗體、CD33Cy5抗體以及相應(yīng)的同型對(duì)照抗體均購(gòu)自BD Biosciences公司(USA)； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transform growth factor-β,TGF-β)、C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)和白介素-10(interleukin-10，IL-10)的 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunoabsorbent assay，ELISA)檢測(cè)試劑盒為北京中科生物公司產(chǎn)品。

3 標(biāo)本采集

參照文獻(xiàn)報(bào)道[2]，本研究以CD14-/CD11b+/CD33+作為創(chuàng)傷患者外周血MDSCs的標(biāo)志。創(chuàng)傷組患者傷后1、3、7d采集外周血2ml，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝，標(biāo)本采集后30min內(nèi)進(jìn)行處理，檢測(cè)CD14-/CD11b+/CD33+細(xì)胞比例。同時(shí)采集2ml外周血(不抗凝)分離血清檢測(cè)細(xì)胞因子水平。

4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血MDSCs比例

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)參照試劑盒說明書進(jìn)行。采集患者外周血(EDTA抗凝)后混勻，取100μl全血，加入CD11b-FITC抗體、CD14-PE抗體、CD33-Cy5抗體各2μl，冰上避光孵育30min，PBS洗滌，紅細(xì)胞裂解液裂解、洗滌、固定、重懸后，以FACS Canto(美國(guó)BD公司)檢測(cè)。

5 ELISA檢測(cè)外周血細(xì)胞因子水平

實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 不同年齡組創(chuàng)傷患者外周血CD14-/CD11b+/CD33+細(xì)胞比例變化

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)青年組和老年組創(chuàng)傷患者外周血CD14-/CD11b+/CD33+細(xì)胞比例，傷后1d MDSCs比例與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； 創(chuàng)傷后3d和7d老年組高于青年組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖1，表1)。

圖1 不同年齡組創(chuàng)傷患者外周血CD14-/CD11b+/CD33+細(xì)胞比例變化。兩組之間行雙因素方差分析； NS： 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；***P<0.001

2 不同年齡組創(chuàng)傷患者血清細(xì)胞因子水平

ELISA檢測(cè)青年組和老年組創(chuàng)傷患者血清TGF-β水平，老年組患者傷后1、3和7d均高于青年組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.001)(表2)。

ELISA檢測(cè)青年組和老年組創(chuàng)傷患者血清IL-10水平，老年組患者傷后1d與青年組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； 3d和7d均高于青年組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(表3)。

ELISA檢測(cè)青年組和老年組創(chuàng)傷患者血清CRP水平，老年組患者傷后1d和7d與青年組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； 3d時(shí)高于青年組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

3 不同年齡組創(chuàng)傷患者外周血MDSCs細(xì)胞比例與血清細(xì)胞因子水平的關(guān)系

創(chuàng)傷患者外周血CD14-/CD11b+/CD33+細(xì)胞比例與血清TGF-β、IL-10和CRP水平進(jìn)行相關(guān)性分析： MDSCs比例與TGF-β水平有相關(guān)性(r=0.8872，P<0.05)； MDSCs比例和IL-10水平有相關(guān)性(r=0.9298，P<0.01)； MDSCs比例與CRP水平有相關(guān)性(r=0.854，P<0.05)。

表1 不同年齡組創(chuàng)傷患者外周血MDSCs比例

各組均數(shù)進(jìn)行雙因素方差分析:*P<0.001

表2 不同年齡組創(chuàng)傷患者血清TGF-β水平

各組均數(shù)進(jìn)行雙因素方差分析：*P<0.01，**P<0.001

表3 不同年齡組創(chuàng)傷患者血清IL-10水平

各組均數(shù)進(jìn)行雙因素方差分析：*P<0.001

表4 不同年齡組創(chuàng)傷患者血清CRP水平

各組均數(shù)進(jìn)行雙因素方差分析：*P<0.05

討 論

創(chuàng)傷時(shí)機(jī)體發(fā)生一系列復(fù)雜的免疫反應(yīng)。在早期產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子，表現(xiàn)為“過度”的炎癥反應(yīng)和全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)； 與此同時(shí)，機(jī)體分泌大量抗炎細(xì)胞因子，產(chǎn)生抗炎反應(yīng)以維持內(nèi)環(huán)境平衡，強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng)又會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)免疫紊亂和免疫抑制，T細(xì)胞功能障礙，機(jī)體對(duì)細(xì)菌的清除能力下降，發(fā)生繼發(fā)感染。隨著重癥醫(yī)學(xué)的發(fā)展和生命支持技術(shù)的進(jìn)步，后期免疫抑制和繼發(fā)感染已成為創(chuàng)傷患者的主要死亡原因。

髓源抑制細(xì)胞(myeloid derived suppressor cells，MDSCs)是重要的調(diào)節(jié)性細(xì)胞，在維持機(jī)體免疫系統(tǒng)平衡中起重要作用[2]。大量研究已證實(shí)MDSCs在創(chuàng)傷和膿毒癥免疫抑制中起重要作用,它與衰老引起的免疫功能衰退也密切相關(guān)。在鼠類，MDSCs表型為CD11b+/Gr-1+，但在人類，目前尚未發(fā)現(xiàn)MDSCs特異專一的分子標(biāo)志。已有文獻(xiàn)表明其表達(dá)CD11b+、CD33+、CD14-、CD13+、HLA-DR-/low，也表達(dá)CD31、CD-124、白介素-4受體α鏈和巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體[2-4,7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷患者外周血CD14-/CD11b+/CD33+MDSCs比例顯著增高，與患者繼發(fā)感染密切相關(guān)[7]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，老年小鼠骨髓中CD11b+/Gr-1+細(xì)胞比例顯著高于青年組，而且對(duì)T細(xì)胞增殖具有強(qiáng)烈的抑制活性，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)水平顯著高于青年組，與荷瘤小鼠中MDSCs表型一致。雖然文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于人類MDSCs表型各不相同，但迄今為止報(bào)道最多的MDSCs表型為CD14-/CD11b+/CD33+/HLA-DR-，因此本研究采用CD14-/CD11b+/CD33+作為標(biāo)志物檢測(cè)創(chuàng)傷患者外周血MDSCs比例變化。我們比較了青年組和老年組創(chuàng)傷患者外周血CD14-/CD11b+/CD33+細(xì)胞比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，傷后1d兩組無(wú)顯著差異(P>0.05)，但傷后3d和7d，老年組MDSCs比例均較青年組顯著增高(P<0.001)。老年創(chuàng)傷患者感染發(fā)生率顯著高于青年組患者。本研究結(jié)果表明，老年創(chuàng)傷患者傷后外周血CD14-/CD11b+/CD33+細(xì)胞比例顯著增高，提示它們?cè)趧?chuàng)傷后免疫功能障礙中起重要作用。

本研究中，傷后1d時(shí)，老年組MDSCs比例較青年組稍增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其原因可能是MDSCs比例在創(chuàng)傷后逐步增高，因此在創(chuàng)傷后1d時(shí)，兩組還未表現(xiàn)出顯著差異。另外，更理想的是能同時(shí)分離MDSCs，分析它對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制活性。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，老年小鼠MDSCs的抑制活性顯著高于青年組小鼠。但在臨床患者，外周血中MDSCs數(shù)量較少，難以獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行抑制活性檢測(cè)。

值得注意的是，MDSCs是高度異質(zhì)性的細(xì)胞，在創(chuàng)傷和膿毒癥不同階段，其特性有所不同[12]。膿毒癥3d時(shí)的MDSCs輸注到盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)小鼠時(shí)，可增強(qiáng)其促炎細(xì)胞因子分泌，減少腹腔細(xì)菌生長(zhǎng)，但增加CLP小鼠早期死亡率。過繼輸注CLP后12d的MDSCs效應(yīng)則與此相反。不同時(shí)期MDSCs分泌的炎癥介質(zhì)也有很大區(qū)別。隨著膿毒癥病程進(jìn)展，MDSCs的表型也隨之轉(zhuǎn)變，由促炎狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦怀墒臁⒕哂懈鼜?qiáng)抗炎活性狀態(tài)，但其共同特點(diǎn)是均對(duì)T細(xì)胞功能具有強(qiáng)烈的抑制活性，均會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞功能障礙。

TGF-β和IL-10均為重要的抗炎細(xì)胞因子，且均參與誘導(dǎo)MDSCs的產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示，老年組創(chuàng)傷患者血清TGF-β和IL-10水平均較青年組高，提示老年組患者在創(chuàng)傷后更容易發(fā)生免疫抑制。同時(shí)，更高的TGF-β和IL-10水平也可能是MDSCs比例增高的重要原因。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，老年創(chuàng)傷患者較青年創(chuàng)傷患者更容易出現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)。老年創(chuàng)傷患者外周血MDSCs數(shù)量較青年患者顯著增高，可能是其發(fā)生免疫抑制的重要機(jī)制，應(yīng)進(jìn)一步深入研究老年患者M(jìn)DSCs擴(kuò)增和活化的分子機(jī)制，以探索新的針對(duì)老年患者有效的免疫調(diào)理方法。

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