周明霞，賀 靖，王潔瓊，李 浩，施佳辰，安玉會(huì)

(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南 鄭州 450052)

靈芝L08對(duì)CD34+肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖及CD34表達(dá)的影響

周明霞，賀 靖，王潔瓊，李 浩，施佳辰，安玉會(huì)

(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南 鄭州 450052)

目的探討靈芝L08對(duì)CD34+肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖及其CD34蛋白表達(dá)的影響。方法培養(yǎng)肝癌SMMC-7721細(xì)胞，并用靈芝L08處理，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定肝癌SMMC-7721細(xì)胞中CD34+肝癌SMMC-7721細(xì)胞數(shù)量，Western blot法測(cè)定CD34蛋白的水平。結(jié)果靈芝L08處理肝癌SMMC-7721細(xì)胞后，細(xì)胞增殖率及CD34+肝癌SMMC-7721細(xì)胞數(shù)量都有所降低，CD34+肝癌SMMC-7721細(xì)胞的CD34蛋白表達(dá)水平也降低(P<0.05)。結(jié)論靈芝L08能抑制CD34+肝癌細(xì)胞的增殖及CD34蛋白的表達(dá)。

靈芝；肝癌SMMC-7721細(xì)胞；CD34；細(xì)胞增殖

目前，肝癌總體治療效果仍不理想，而導(dǎo)致其治療困難、病死率高的主要原因就是治療后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。L08是本實(shí)驗(yàn)室從靈芝中提取出的三萜類化合物，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，具有極大的抗腫瘤潛力[1]。本研究旨在觀察靈芝L08對(duì)CD34+肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖及其CD34蛋白表達(dá)的影響，為靈芝L08應(yīng)用于肝癌臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料L08(自制)；胎牛血清、DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；環(huán)磷酰胺(天津金世制藥有限公司)；鏈霉素-青霉素雙抗(美國(guó)Amresco公司)；胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；DMSO、MTT試劑(美國(guó)Sigma公司)；兔抗人CD34單克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理肝癌SMMC-7721細(xì)胞采用體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清及質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行96孔鋪板，待細(xì)胞過(guò)夜貼壁后，分別用不同濃度(100、300、500 mg·L-1)L08處理細(xì)胞24 h、48 h、72 h后MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況。其中每個(gè)藥物濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組為未經(jīng)任何處理的細(xì)胞。

1.3MTT法測(cè)定肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖情況加藥處理24 h、48 h、72 h的肝癌SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)基中每孔加入 20 μL(5 mg·mL-1)MTT試劑，37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h終止培養(yǎng)。用移液槍吸棄上層培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min充分融解結(jié)晶物。選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定每個(gè)孔的光吸收度，記錄結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以細(xì)胞增殖抑制率表示。細(xì)胞增殖抑制率=[(1-處理組平均OD值)/對(duì)照組平均OD值]×100%。

1.4流式細(xì)胞儀測(cè)定CD34+肝癌SMMC-7721細(xì)胞數(shù)量分別收集加藥處理24 h、48 h、72 h的肝癌SMMC-7721細(xì)胞，加入PBS緩沖液及FITC標(biāo)記的CD34抗體，輕輕吹打混勻，4 ℃避光孵育20 min。終止孵育后，采用PBS緩沖液洗細(xì)胞2次(2 000 r·min-1離心5 min)，加入500 μL PBS緩沖液混勻懸浮細(xì)胞后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5Westernblot法測(cè)定CD34蛋白水平參考文獻(xiàn)[2]中所用的本實(shí)驗(yàn)室前期研究方法進(jìn)行CD34+肝癌SMMC-7721細(xì)胞中CD34蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1靈芝L08對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制見(jiàn)表1。

表1 靈芝L08處理肝癌SMMC-7721細(xì)胞不同時(shí)間后的細(xì)胞增殖的抑制率 %

注：靈芝L08處理細(xì)胞后同一時(shí)間點(diǎn)各組抑制率兩兩比較，P<0.05

2.2靈芝L08對(duì)CD34+肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制見(jiàn)表2。

注：靈芝L08處理細(xì)胞各組抑制率兩兩比較，P<0.05

2.3靈芝L08對(duì)CD34蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)圖1、表3。

圖1 靈芝L08處理肝癌SMMC7721細(xì)胞后CD34蛋白的表達(dá)

A:空白對(duì)照組；B：靈芝L08 100 mg·L-1；C：靈芝L08 300 mg·L-1；D：靈芝L08 500 mg·L-1

表3 靈芝L08處理肝癌SMMC-7721細(xì)胞后CD34蛋白表達(dá)的灰度值

注：靈芝L08處理細(xì)胞各組抑制率兩兩比較，P<0.05

3 討論

肝癌作為我國(guó)發(fā)病率及死亡率均較高的惡性腫瘤之一，其治療大都采取手術(shù)、化療、放療等方法，但總體的治療效果并不好，主要的原因就是術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]。肝癌組織中可能存在極少數(shù)具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞，這是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源[4]。因此對(duì)肝癌干細(xì)胞的研究被認(rèn)為是了解肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的新途徑之一。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物的研究尚無(wú)明確定論。本實(shí)驗(yàn)室前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，靈芝L08可抑制CD133+肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖和CD133蛋白的表達(dá)，由于尚未發(fā)現(xiàn)肝癌干細(xì)胞特異的表面標(biāo)志物，僅選擇CD133作為生物標(biāo)志物，尚不能說(shuō)明靈芝L08可抑制肝癌干細(xì)胞的增殖。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇了以CD34作為另外一種標(biāo)志物，進(jìn)一步驗(yàn)證靈芝L08是否對(duì)肝癌干細(xì)胞產(chǎn)生了作用。CD34作為一種跨膜的表面糖蛋白，在肝癌組織中的表達(dá)主要與腫瘤新生血管有關(guān)，可以作為觀察肝癌血管形成的一個(gè)標(biāo)志物[6]。CD34在正常的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中不表達(dá)，但可作為反映肝竇毛細(xì)血管化的有效指標(biāo)[7]。

研究[8-9]表明，包括L08在內(nèi)的靈芝中的三萜類成分可通過(guò)抑制蛋白激酶C活性同時(shí)激活有絲分裂活性蛋白激酶，使腫瘤細(xì)胞G2期延長(zhǎng)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，最終起到抗腫瘤作用。本研究選擇CD34+肝癌SMMC-7721細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討天然藥物對(duì)其增殖的抑制作用。結(jié)果顯示，靈芝L08可顯著抑制CD34+肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖及CD34蛋白的表達(dá)，且抑制率具有時(shí)間和濃度依從性。說(shuō)明靈芝L08可有效抑制肝癌干細(xì)胞的增殖，這為天然藥物應(yīng)用于臨床肝癌的治療提供了理論依據(jù)。但本實(shí)驗(yàn)尚存在許多不足之處，首先，目前對(duì)三萜類化合物的分離純化存在一定的困難，這就限制了對(duì)這些化合物的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)。其次，目前尚未明確肝癌干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物，所以僅用CD34作為標(biāo)志物說(shuō)服力較弱，尚需進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)從而得到更準(zhǔn)確的結(jié)論。

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EffectofGanodermaL08ontheProliferationandCD34ExpressionofCD34+LiverCancerSMMC-7721Cells

Zhou Mingxia,He Jing,Wang Jieqiong,Li Hao,Shi Jiachen,An Yuhui

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,BasicMedicalCollege,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

ObjectiveTo explore the effect of ganoderma L08 on the proliferation and CD34 expression of CD34+liver cancer SMMC-7721 cells.MethodsLiver cancer SMMC-7721 cells were cultured and treated with ganoderma L08.Cell proliferation was detected by MTT method.The numbers of CD34+liver cancer SMMC-7721 cells were measured by flow cytometry.The level of CD34 protein was measured by western blot method.ResultsAfter the treatment of ganoderma L08,the proliferation rate of liver cancer SMMC-7721 cells and numbers of CD34+liver cancer SMMC-7721 cells were both decreased,and the level of CD34 protein in CD34+SMMC-7721 cells was decreased (P<0.05).ConclusionGanoderma L08 could inhibit the proliferation and CD34 expression in CD34+liver cancer SMMC-7721 cells.

ganoderma; liver cancer SMMC-7721 cells; CD34; cell proliferation

安玉會(huì)(1952-)，男，教授，主要從事老年癡呆發(fā)生的分子機(jī)制及腫瘤干細(xì)胞方面的研究。E-mail：yuhuian@zzu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.04.001

R735.7；R273

A

1673-5412(2014)04-0277-03

2014-01-07)