郝 穎 付秀華 王立紅 高俊珍

肺癌仍居全世界惡性腫瘤發(fā)病率和病死率的首位，手術(shù)切除仍是早期肺癌的首選方案[1]。隨著外科手術(shù)技巧的大幅提升，手術(shù)風(fēng)險和圍手術(shù)期并發(fā)癥的發(fā)生率得到了明顯改善，但這并沒有同等程度延長肺癌患者術(shù)后生存的時間。據(jù)報道，醫(yī)院收治的可根治切除的Ⅰ期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者5年生存率約為60%～70%，但仍有部分患者死于肺癌的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，生存率不容樂觀[2-3]。

NSCLC的高病死率歸因于腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，部分患者在診斷初期已經(jīng)發(fā)生了微轉(zhuǎn)移。微轉(zhuǎn)移指惡性腫瘤細胞在發(fā)展過程中，播散并存活于淋巴道、外周血、骨髓及各種器官中尚未形成顯性轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移部位也無任何臨床表現(xiàn)，常規(guī)影像學(xué)和病理學(xué)等檢查均難以檢測發(fā)現(xiàn)的一種微量轉(zhuǎn)移特征。研究已發(fā)現(xiàn)多種與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的分子腫瘤標(biāo)記物，包括細胞角蛋白家族、癌胚抗原、黏蛋白-1(MUC1)、EGFR、肺組織特異性X蛋白等。部分因子在腫瘤生物學(xué)行為中扮演了重要角色，有可能作為早期預(yù)測NSCLC患者術(shù)后是否轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)。本研究通過檢測NSCLC患者外周血中CK19、LunX、KS1/4的表達，探討其與NSCLC微轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

材料與方法

一、病例資料

收集2010年2月至2012年5月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科A、B病區(qū)行肺葉切除加淋巴結(jié)清掃術(shù)的非小細胞肺癌患者52例。術(shù)前均通過支氣管鏡或經(jīng)皮肺穿刺、痰脫落細胞學(xué)等檢查病理證實為NSCLC，術(shù)前術(shù)后未經(jīng)放、化療、靶向等抗腫瘤治療。選擇同期行局部支氣管擴張肺葉切除術(shù)、肺結(jié)核切除術(shù)、肺部錯構(gòu)瘤切除手術(shù)的患者20例作為對照組。

二、實驗分組

入選患者分別于術(shù)后3個月、6個月和9個月復(fù)查胸部增強CT、腹部增強CT, 頭顱MRI、全身同位素骨掃描或PET-CT等檢查判斷是否發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。經(jīng)隨訪后將52例患者再分為兩組，將發(fā)生腫瘤局部復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移的病例命名為轉(zhuǎn)移組，未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的病例命名為無轉(zhuǎn)移組。轉(zhuǎn)移組：共18例，其中男性13例，女性5例，平均年齡60.9±8.3歲；鱗癌9例，腺癌7例，黏液表皮樣癌1例，肺泡細胞癌1例，Ⅱa～Ⅱb期10例，Ⅲa期8例。無轉(zhuǎn)移組：共34例，其中男性28例，女性6例，平均年齡(59.1±8.3)歲；鱗癌14例，腺癌10例，支氣管肺泡細胞癌4例，大細胞癌2例，混合型癌4例；Ⅰa～Ⅰb 期8例，Ⅱa～Ⅱb期10例，Ⅲa期16例。對照組：男性14例，女性6例，平均年齡(50.1±2.2)歲。

三、實驗方法

1.標(biāo)本的采集及提取總RNA：采集肘靜脈新鮮外周血2 ml放入EDTA抗凝管中，迅速放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。棄去開始的1 ml避免上皮細胞的污染。取抗凝血2 ml，以離心半徑8 cm，12 000 r/min，離心5 min，棄上清，將4 ℃冰箱內(nèi)預(yù)冷的紅細胞裂解液以6︰1的比例加入到細胞沉淀中，吹打混勻后靜置，以離心半徑8 cm，1000 r/min，離心5 min，收集沉淀部分，生理鹽水離心洗2次，收集沉淀，采用總RNA提取試劑盒提取總RNA(北京天根生化科技公司，離心柱型，DP419)。

2. 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA：采用大連TAKARA公司PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser，按說明配制反應(yīng)液體系1，冰上進行：5×g DNA Eraser Buffer 2 μl、gDNA Eraser 1 μl、Total RNA 1 μg、余下為RNaseFree dH2O至總體積10 μl，42 ℃ 2 min后放入4 ℃保存；配制反應(yīng)液體系2： 5×PrimeScript?Buffer 2 4 μl、PrimeScript?RT Enzyme Mix I 1 μl、RT primer Mix 1 μl、體系1 反應(yīng)液 10 μl、RNaseFree dH2O至體系20 μl，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，最后4 ℃，反應(yīng)結(jié)束后，cDNA放置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.熒光定量PCR反應(yīng)：委托TAKARA生物技術(shù)公司完成引物序列的設(shè)計及合成，見表1。應(yīng)用熒光定量PCR分析儀(美國ABI 7500fast)完成。按SYBR?Premix Ex Tap TM II (Perfect Real Time)(TAKARA Code: DRR081A)說明書完成反應(yīng)體系的配制。

冰上配制PCR反應(yīng)液：SYBR?Premix Ex TapTM Ⅱ(2×) 25 μl、PCR Forward Primer (10 μM)2.0 μl、PCR Reverse Primer(10 μM) 2.0 μl、ROX Reference Dye II(50×)1.0 μl、cDNA 4.0 μl、d H2O 16.0 μl，95 ℃ 30 s滅活逆轉(zhuǎn)錄酶及預(yù)變性，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

表1 CK19、LunX、KS1/4和GAPDH引物序列及擴增長度

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

經(jīng)過隨訪，52例患者中發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)共18例，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率34.6%(18/52)。

一、總RNA抽提結(jié)果

通過紫外分光光度儀檢測RNA純度，轉(zhuǎn)移組OD268/280值在1.612～1.98之間，RNA濃度在100～1370 μg/ml之間；未轉(zhuǎn)移組OD268/280值在1.732～2.1之間，RNA濃度在140～1020 μg/ml之間；良性病變組OD268/280值在1.800～2.0之間，RNA濃度在500～1410 μg/ml之間。經(jīng)瓊脂糖膠電泳，紫外線燈下觀察可見2條清晰可見亮條帶，分別代表28 s和18 s，28 s亮度、寬度約為18 s條帶的2倍。

二、熒光定量PCR結(jié)果

根據(jù)擴增曲線記錄目標(biāo)基因的平均CT值，即基因成指數(shù)擴增起始時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。本實驗采用2-△△CT方法比較組織中各目標(biāo)基因的表達差異,當(dāng)擴增效率接近1時，可用2-△Ct表示目的基因在組織中的相對表達量(ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH)，ΔCt值與基因的表達量呈反比關(guān)系，ΔCt越低，提示基因表達量越高。GAPDH的CT值在15～25之間，目的基因產(chǎn)物的CT值在15～35之間，見圖1～8。

三、NSCLC轉(zhuǎn)移組、無轉(zhuǎn)移組與肺良性病變外周血標(biāo)本中三種因子表達比較

外周血中CK19mRNA的ΔCt值在轉(zhuǎn)移組、無轉(zhuǎn)移組及對照組呈遞增關(guān)系，說明其CK19mRNA的表達量呈遞減趨勢，轉(zhuǎn)移組中CK19mRNA的表達量高于無轉(zhuǎn)移組及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.038)；這種關(guān)系也同樣體現(xiàn)在LunX mRNA上，轉(zhuǎn)移組外周血中LunX mRNA的表達量高于無轉(zhuǎn)移組及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.034)；KS1/4 mRNA的表達也同樣是這種趨勢，但P值并無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

四、轉(zhuǎn)移組患者外周血中不同因子的表達差異

我們分別對轉(zhuǎn)移組外周血中三種因子的表達量做了比較，結(jié)果顯示LunXmRNA表達量最高，KS1/4mRNA 其次，CK19mRNA表達最低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)，見表2。

表2 三組患者外周血標(biāo)本三種因子ΔCt值表達比較

圖1 GAPDH熔解曲線 圖2 CK19熔解曲線 圖3 LunX熔解曲線 圖4 KS1/4熔解曲線

圖5 GAPDH擴增曲線 圖6 CK19擴增曲線 圖7 LunX擴增曲線 圖8 KS1/4擴增曲線

討 論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的生物過程，微轉(zhuǎn)移只是其中的一個階段，多種分子生物共同參與其發(fā)生和發(fā)展。腫瘤細胞從原發(fā)病灶脫落后，隨血運或淋巴管播散到新環(huán)境，但并非一定形成轉(zhuǎn)移灶。動物實驗表明經(jīng)靜脈注射癌細胞后而只有0.01%最終形成了轉(zhuǎn)移灶，絕大部分進入血液循環(huán)的腫瘤細胞被機體免疫吞噬清除，循環(huán)內(nèi)必須有大量腫瘤細胞播散后方有機會形成遠處轉(zhuǎn)移[4]。不可避免的是仍有部分早期癌癥患者要遭受腫瘤細胞的脈管侵犯，導(dǎo)致腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移。張靜淵等[5]在研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞的脈管內(nèi)侵犯與腫瘤的胸膜浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，但與年齡、腫瘤大小、分化程度無關(guān)(P>0.05)，提示腫瘤的脈管侵犯預(yù)示著遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生，較傳統(tǒng)的TNM分期能更早一步準(zhǔn)確評估預(yù)后，而腫瘤脈管侵犯常與外周血中CK19mRNA表達呈正相關(guān)。

CK19是被廣泛研究并公認的腫瘤標(biāo)記物之一，其在肺癌、胃癌、食管癌、宮頸癌、乳腺癌、喉癌中的研究最多[6-10]。上皮細胞的過表達是腫瘤生物活動的主要表現(xiàn)形式，CK19為上皮細胞家族中的敏感性最高的片段，被認為與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，血清檢測CK19片段診斷非小細胞肺癌的特異性達87%。Ge等[11]認為CK19 mRNA在NSCLC淋巴結(jié)中陽性表達可作為預(yù)測預(yù)后的獨立指標(biāo)，并可作為肺癌臨床分期的補充。本研究的受試對象經(jīng)術(shù)后隨訪發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)發(fā)生率為34.6%(18/52)。發(fā)生轉(zhuǎn)移組患者外周血中CK19mRNA的表達與未發(fā)生轉(zhuǎn)移組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，轉(zhuǎn)移組LunX mRNA在外周血的表達也明顯高于無轉(zhuǎn)移組，與CK19mRNA的表達基本一致，且兩組中CK19mRNA、LunX mRNA的表達均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明CK19和LunX與NSCLC轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，部分NSCLC患者其實在手術(shù)治療前已經(jīng)發(fā)生腫瘤細胞血液浸潤，CK19和LunX能在一定程度上預(yù)測轉(zhuǎn)移的發(fā)生。朱廣迎等[12]通過6～16個月的短期隨訪發(fā)現(xiàn)LunX基因表達陽性組復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率為52%，陰性組復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率僅為18%。而Yu等[13]認為LunX基因不僅能輔助診斷非小細胞肺癌，且對病理分型有指向性意義。牛瑞等[14]認為患者的生存時間與LunX mRNA的表達有相關(guān)性，這與我們的研究結(jié)果一致。CK19、LunX陽性表達一定程度上提示腫瘤負荷增加，預(yù)示微轉(zhuǎn)移的存在，術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的風(fēng)險增加，可以作為診斷NSCLC微轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。

上皮癌相關(guān)基因(epithelial carcinoma-associated gene, KS1/4)是一種上皮細胞表面抗原，為超級免疫球蛋白家族中的黏著蛋白的一種[15-16]，因能結(jié)合多種不同單克隆抗體而被識別。KS1/4橫跨于細胞膜表面，在細胞增殖、成形過程中起粘連及細胞核信號傳導(dǎo)作用[17-18]。 KS1/4最初發(fā)現(xiàn)表達于結(jié)腸癌、胃腸癌、胰腺癌等上皮細胞內(nèi)，后來許多研究在肺癌、前列腺癌、肝癌細胞中也檢測到KS1/4的陽性表達，故稱其為上皮癌相關(guān)基因。目前，KS1/4已經(jīng)被認為是一種癌相關(guān)蛋白因子，通過癌細胞的跨膜蛋白水解[17, 19]和在干細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用[20-22]。Mitas等[23]通過RT-PCR對NSCLC患者淋巴結(jié)LunX, KS1/4, CEA, CK19和MUC1做了檢測，首次提出KS1/4為診斷NSCLC特異性最高的標(biāo)記物。Wallace等[24]采用RT-PCR檢測NSCLC患者淋巴結(jié)中LunX、MUCl。KS1/4, CEA, CK19 及 PSE的表達結(jié)果顯示，KS1/4的陽性表達率為25%，被認為是發(fā)現(xiàn)腫瘤微轉(zhuǎn)移最特異的基因。本實驗檢測外周血中KS1/4mRNA的表達發(fā)現(xiàn)，其在三組中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。我們推論KS1/4可能在腫瘤發(fā)生早期有一定生物學(xué)行為，尤其在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了作用，其在外周血的檢測診斷微轉(zhuǎn)移意義需重新定位。KS1/4可能在外周血內(nèi)表達量低或不表達，或受其他因素影響而表達量降低，如是否存在競爭抑制等等，導(dǎo)致外周血中檢測陽性率低。

本研究還對轉(zhuǎn)移組內(nèi)因子間的表達差異對了對比，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)移組外周血中LunXmRNA的表達最高，KS1/4mRNA其次，CK19mRNA的表達最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)，提示LunX在外周血檢測診斷微轉(zhuǎn)移的特異性較KS1/4、CK19高。Mitas等[23]在實驗中應(yīng)用實時定量 PCR 技術(shù)檢測 24 例Ⅰ～Ⅳ期NSCLC患者外周血LUNX，MUC1, KS1/4, CEA，CK19 及 PSE 的表達，其中LUNX 陽性表達率最高, 為 42%，認為其特異性表達與肺癌的發(fā)生關(guān)系密切。這與我們的實驗結(jié)果符合，更進一步證實了我們的結(jié)論。

腫瘤細胞最終是否形成轉(zhuǎn)移與癌細胞的自身生物學(xué)行為、機體免疫及營養(yǎng)狀態(tài)、術(shù)式的選擇、淋巴結(jié)清掃情況、局部微循環(huán)等多因素共同參與有關(guān)。目前臨床應(yīng)用TNM 分期為NSCLC患者做預(yù)后評價，微轉(zhuǎn)移的存在為分子分期(TNMB)提供了有力的依據(jù)。綜上所述，雖然本研究樣本例數(shù)偏少，但還是得到了與國外關(guān)于NSCLC微轉(zhuǎn)移的多項研究相似的結(jié)論，因此，我們認為CK19、LunX可以作為預(yù)測NSCLC轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的指標(biāo)，輔助診斷NSCLC微轉(zhuǎn)移，其中LunX的敏感性略顯優(yōu)勢。

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