吳 岳 王海燕 張 偉 趙海龍 董紅梅 王 靜

肺泡Ⅱ型細(xì)胞(ATⅡ)占肺泡上皮的60%，對肺泡正常結(jié)構(gòu)和功能的維持具有非常重要的作用。已有研究提示，ATⅡ是肺泡上皮細(xì)胞的祖細(xì)胞，也是肺泡上皮的干細(xì)胞[1]。在細(xì)胞的更新及損傷的修復(fù)過程中，ATⅡ既可以分化成Ⅰ型細(xì)胞，還可通過進(jìn)行有絲分裂來補(bǔ)充自身數(shù)量。相關(guān)研究表明，ATⅡ細(xì)胞上存在鈉水通道，它與肺泡內(nèi)液體的產(chǎn)生和清除關(guān)系密切，在肺水的清除中起著維持細(xì)胞內(nèi)外液體平衡的作用[2]。但ATⅡ與高原低氧肺損傷關(guān)系的研究少見。為此，我們觀察了急進(jìn)高原不同時間大鼠肺臟的細(xì)胞學(xué)形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)變化，并測定了肺泡液體清除率(alveolar liquid clearance, ALC)，旨在探討ATⅡ肺水轉(zhuǎn)運(yùn)功能與高原肺損傷的關(guān)系。

材料與方法

一、實驗材料

從西安(海拔400 m)購買Wistar雄性大鼠60只，體重210～230 g，隨機(jī)分為4組，每組15只。對照組(T0組)在平原(海拔400 m)進(jìn)行實驗檢測，另外3組在10 h內(nèi)快速運(yùn)送到海拔4300 m的青海省瑪多縣，分別于急進(jìn)高原24 h(T1組)、72 h(T2組)、168 h(T3組)進(jìn)行實驗。

二、研究方法

1. 氣管插管和頸動脈插管:檢測前1 h用3%戊巴比妥鈉(150 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉后進(jìn)行氣管切開插管，采用小動物呼吸機(jī)(Model 683)行呼吸末正壓通氣(PEEP為2.20 mmHg)，吸氧濃度1.0，呼吸頻率60次/min，潮氣量10 ml/ka，氣道壓低于11.0 mmHg。右側(cè)頸動脈行PE50導(dǎo)管插管，用血流動力學(xué)檢測儀(CARDIOMAX-Ⅱ)監(jiān)測血壓。術(shù)后靜置1 h，并且把心率維持在300次/min以下。

2．灌注液的配置：按文獻(xiàn)方法配置5%小牛血清、乳酸鈉林格氏液加伊文思藍(lán)(1 g/L)和I125-白蛋白灌注液[3]。移去呼吸機(jī)接頭，用5 ml注射器將灌注液10 ml/kg[每只鼠按74kBq(1Ci=3.7×107kBq)]和0.5 ml空氣注入大鼠肺內(nèi)，連接呼吸機(jī)，繼續(xù)通氣。灌注前及灌注后10、30、60 min分別記錄大鼠心率、血壓，并經(jīng)頸動脈插管抽取動脈血行血氣分析。

3. ALC計算：1 h后放血活殺大鼠，取出完整肺。將干燥PE50導(dǎo)管(becton dickinson, US)通過氣管插至肺邊緣部位，然后吸出肺泡內(nèi)液體，盛于已經(jīng)稱重過的200 μl離心管內(nèi)(1/1000 g精密天平)，再次稱量離心管重量，兩者之差即為吸出液體量(Mf)。用R計數(shù)儀(SN682型，上海)讀取1 min r計數(shù)(G)，按公式計算每毫克放射量(Cf)。再取約100 μl灌注液原液，同樣方法測量原液的Gi和Mi，并計算Ci和ALC。利用下列公式計算ALCCi=Gi/Mi；Cf=Gf/Mf；ALC(%)=(1-Ci/Cf)×100%。

4. 光鏡和電鏡觀察：各組大鼠活體解剖，觀察肺組織大體形態(tài)學(xué)變化。取一側(cè)肺，用10%甲醛緩沖液固定，然后石碏包埋和切片，用蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色。Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。部分肺組織標(biāo)本用4%戊二醛及1%鋨酸混合液固定后，分別進(jìn)行梯度乙醇脫水，經(jīng)環(huán)氧樹脂包埋并行超薄切片后，在電鏡下觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)變化。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組大鼠ALC比較

T1組、T2組大鼠ALC(分別為22.60±3.41%、25.28±6.30%)較T0組大鼠(41.14±9.36%)顯著降低(均P<0.05)，T3組(45.52±10.05%)與T0組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

二、光鏡觀察

光鏡下見T1、T2組大鼠肺組織炎癥反應(yīng)明顯，肺泡壁毛細(xì)血管充血水腫，肺泡腔內(nèi)有液體和較多炎細(xì)胞聚集。肺組織中偶見有單個散在分布的凋亡細(xì)胞，周圍無炎性細(xì)胞浸潤。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞體積較小，呈立方形，細(xì)胞核較大呈圓形，核染色質(zhì)致密濃縮，整個細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，鏡下見部分組織出現(xiàn)壞死，細(xì)胞呈現(xiàn)核碎裂，胞漿呈淡紅色。T0組及T3組大鼠肺臟病變相對較輕。

三、電鏡觀察

T1組、T2組大鼠肺臟大多數(shù)細(xì)胞的胞膜微絨毛減少或消失，部分Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞體積縮小、變圓。有些細(xì)胞胞漿嗜俄性板層小體數(shù)量減少，排空增加；細(xì)胞核呈現(xiàn)多形性，并見有假包涵體形成；可見染色質(zhì)聚集、靠近核膜和核被膜內(nèi)陷或外折等征象，見圖1、圖2。T0組及T3組大鼠肺超微結(jié)構(gòu)變化輕于T1及T2組。

圖1 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞核染色質(zhì)固縮

圖2 左下方為肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，胞質(zhì)有大量已經(jīng)排空的板層小體，核染色質(zhì)濃縮，固縮

討 論

ATⅡ細(xì)胞具有跨模主動運(yùn)轉(zhuǎn)功能和分泌生物活性物質(zhì)的能力，在肺上皮更新以及組織損傷修復(fù)過程中起著干細(xì)胞的作用[1]。同時，ATⅡ細(xì)胞又因為其在不同的生理條件下能表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類分子，炎癥介質(zhì)和分泌細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)，而被看作是重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞之一，具有調(diào)節(jié)免疫以及防御的作用。

近年對ATⅡ功能的深入了解使人們對急性肺水腫形成機(jī)制有了新的認(rèn)識。既往研究有資料表明肺泡兩側(cè)壓力差可能是導(dǎo)致急性肺水腫的直接原因。近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞具有很強(qiáng)的液體轉(zhuǎn)運(yùn)能力，對維持肺泡內(nèi)液體的平衡有著一定的作用 。Folkesson等[4]曾對博來霉素引起大鼠亞急性肺損傷的肺水轉(zhuǎn)運(yùn)功能做了連續(xù)的觀察，通過檢測I125標(biāo)記的白蛋白變化量來推算肺泡液體通透性的改變，隨后計算ALC。發(fā)現(xiàn)肺損傷后1 h， ALC下降110%，4 h后ALC下降75%，60 d后方恢復(fù)正常。并且發(fā)現(xiàn)肺泡上皮對蛋白的通透性呈現(xiàn)顯著增加。但肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞上鈉離子通道數(shù)量減少了52%，說明肺泡液體通過單個細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降?；谝陨蠈嶒灒芯空哒J(rèn)為肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞數(shù)量的增加可能是肺水清除率增加的主要原因[4]。

急性肺損傷后的ATⅡ的變化比較復(fù)雜。肺泡表面活性物質(zhì)的合成及分泌功能發(fā)生損傷，肺泡內(nèi)液體轉(zhuǎn)運(yùn)能力不足或者肺表面活性物質(zhì)滅活增加，均可以引起肺泡內(nèi)外液體失衡，從而引起急性肺損傷。ATⅡ數(shù)量的增加和細(xì)胞的分化不僅可以修復(fù)損傷肺泡的結(jié)構(gòu)，還能有效地促進(jìn)其功能恢復(fù)，進(jìn)而可能阻止肺損傷的發(fā)展。有實驗表明生長因子可以部分促進(jìn)ATⅡ的增殖，可能為急性肺損傷的治療提供理論依據(jù)。本實驗結(jié)果提示急進(jìn)高原大鼠24 h、72 h后ALC明顯下降，究其原因，可能與下列原因有關(guān)：①急進(jìn)高原大鼠受到高原環(huán)境包括低氧、高寒的強(qiáng)烈刺激，引起ATⅡ凋亡，導(dǎo)致ATⅡ的數(shù)量明顯減少，肺水清除率明顯下降，大量的液體積聚在肺泡腔內(nèi)，從而引發(fā)肺損傷；②急進(jìn)高原大鼠ATⅡ發(fā)生凋亡，呈現(xiàn)細(xì)胞膜上的多數(shù)微絨毛減少或消失，而且線粒體出現(xiàn)明顯腫脹[5]，板層小體的數(shù)量出現(xiàn)了減少、排空增加，形成了假包涵體，同時可見核染色質(zhì)濃縮。這些變化可能影響了氣血屏障和呼吸膜的完整性，從而導(dǎo)致肺損傷。

ATⅡ除了合成和釋放表面活性物質(zhì)外，膜上還存在著不同的離子通道如鈣離子通道、阿米洛利敏感的鈉通道(ENaC)、氯通道(CFTR)、鉀通道和Na+-K+-ATP酶、布美他尼敏感的Na+-K+-Cl-共同轉(zhuǎn)運(yùn)體等，這些通道共同完成肺泡上皮離子的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。在這些通道蛋白的研究中，水通道蛋白(aquaporins, AQPs)的研究明顯受到重視，但針對ATⅡ水通道蛋白的研究報道較少[6-7]。種種跡象表明AQPs的變化可能影響肺組織的功能[8-9]。本研究結(jié)果提示，急進(jìn)高原大鼠24 h、72 h ALC明顯下降，可能與鈉水通道的改變有關(guān)。至于是哪種水通道蛋白在高原肺損傷的發(fā)生機(jī)制中起作用以及具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

本實驗顯示，急進(jìn)高原168 h大鼠(T3組)ALC恢復(fù)到平原大鼠(T0組)的水平，可能與ATⅡ的增殖和修復(fù)有關(guān)，其具體機(jī)制尚不清楚。應(yīng)用某些促進(jìn)ATⅡ增殖和修復(fù)的生長因子，可能對高原肺損傷的治療有益。

參 考 文 獻(xiàn)

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3 Wang Y, Folkesson HG, Jayr C, et al. Alveolar epithelial fluid transport can be simultaneously upregulated by both KGF and beta-agonist therapy[J]. J Appl Physiol, 1999, 87(5): 1852-1860.

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6 何 琳, 李濤平. 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞鈉通道在肺水清除中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究進(jìn)展[J]. 國外呼吸雜志, 2007, 27(12): 919-921.

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